Isolamento, caracterização e regulação de genes que codificam pectato liase em Crinipellis perniciosa, agente etiológico da vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao) - Santos, Jildete Karla dos (2006)
Neste trabalho, genes que codificam a enzima pectinolítica pectato liase foram isolados do genoma do fungo Crinipellis perniciosa, agente etiológico da doença vassoura-de-bruxa do cacaueiro. Enzimas pectinolíticas vêm sendo correlacionadas com a patogenicidade de alguns fungos fitopatogênicos. Buscas preliminares realizadas no Banco de Dados do Projeto Genoma Vassoura de Bruxa , revelaram a presença de seqüências, no genoma de C. perniciosa, com similaridade à pectato liases de diferentes fungos. Duas seqüências, com similaridade com a pectato liase A de Aspergillus niger e a pectato liase D de Fusarium solani f. sp. pisi, foram utilizadas para a construção de oligonucleotídeos específicos. Os fragmentos de DNA amplificados foram utilizados como sondas homológas na determinação do número de cópias destes genes no genoma de C. perniciosa e no isolamento de genes que codificam pectato liase em um Banco Genômico de C. perniciosa, construído no bacteriófago λEMBL3. Análise de hibridização com DNA total de C. perniciosa, clivado com as enzimas BamHI, EcoRI e XbaI, revelaram a presença de, pelo menos, 2 cópias do gene que codifica pectato liase com similaridade à pectato liase A de A. niger e uma cópia do gene que codifica pectato liase com similaridade à pectato liase D de F. solani f. sp. pisi. Com base nesta caracterização inicial três genes, pec1A, pec1B e pec2, foram isolados no Banco Genômico de C. perniciosa e caracterizados. Os genes pec1A e pec1B possuem, respectivamente, regiões codificadoras de 1141 e 1346 pb e são ambas interrompidas por 7 íntrons. O gene pec2 possui uma região codificadora de 936 pb e está interrompida por apenas 3 íntrons. A completa análise dos promotores não foi possível, entretanto, alguns ciselementos envolvidos na regulação de genes puderam ser identificados em pec1B e pec2. As proteínas codificadas por pec1A, pec1B e pec2 possuem respectivamente, 244, 307 e 253 aminoácidos. As proteínas PEL1A, PEL1B apresentaram 60% identidade entre si, mas baixa identidade, 4,3 e 4,6%, respectivamente, com PEC2. Quando comparadas com outras pectato liases de fungos, PEC1A E PEC1B apresentaram maior identidade com pectato liase A de A. niger e A. fumigatus. A enzima PEC2, por sua vez apresentou maior identidade com proteínas de um novo grupo de pectato liases, representado pela família multigênica que codificam pectato liases em F. solani. f. pisi. Alinhamentos múltiplos entre as pectato liases de C. perniciosa e de diferentes fungos fitopatogênicos, bem como a análise filogenética realizada, sugerem que PEC2 realmente pertence a uma nova classe de pectato liase, juntamente com as pectato liases de F. solani f.sp. pisi. Os genes pec1A e pec1B foram expressos em todas as fontes de carbono avaliadas, como em pectina, pectina e glicose, glicose e polpa de cacau, bem como em pectina em pH 4,0, 6,8 e 8,0. Entretanto, diferenças no nível de expressão destes genes foram detectadas, como a maior expressão dos genes pec1A e pec1B em valores de pH igual à 8,0. Já pec2 não foi expresso em nenhuma das condições avaliadas. A maior atividade enzimática detectada no extrato de proteínas do micélio, juntamente com a observação de que os genes que codificam pectato liase de C. perniciosa não respondem à repressão catabólica, sugerem que algumas destas enzimas podem estar ligadas à parede celular e, assim, sujeitas a um controle pós-traducional. Este é o primeiro relato do isolamento e caracterização de genes que codificam pectato liase em basidiomicetos.