Identificação e caracterização de uma poliuretanase com atividade lipolítica secretada por Serratia liquefaciens L135 isolada de leite cru - Salgado, Cleonice Aparecida (2019)
Serratia liquefaciens é uma bactéria frequentemente encontrada no leite cru refrigerado e possui alto potencial de deterioração proteolítica. Neste trabalho, o potencial lipolítico de S. liquefaciens L135, isolada do leite cru refrigerado, foi avaliado e uma enzima lipolítica foi purificada e caracterizada. A atividade lipolítica de S. liquefaciens L135 foi verificada em diferentes temperaturas, sendo 30 °C a temperatura ótima de atividade da enzima. A termoestabilidade da enzima foi avaliada em leite desnatado reconstituído a 10% e o valor D encontrado nas temperaturas de 65, 72, 85 e 95 °C foi de, aproximadamente, 97, 66, 50 e 28 min, respectivamente. O valor Z da enzima foi de 60 °C e a simulação do tempo / temperatura de pasteurização lenta e rápida não resultou na inativação completa da atividade lipolítica. Além disso, esta enzima foi purificada 3,1 vezes com 21,5% de recuperação e apresentou, por zimografia, massa molecular de, aproximadamente, 65 kDa. A identificação por LC-MS/MS indicou tratar-se de uma poliuretanase, com massa molecular teórica de 64,864 kDa, confirmando a estimativa feita por zimografia, e pI teórico de 4,35. A poliuretanase homóloga identificada possui 615 resíduos de aminoácidos, sequência altamente conservada de lipase (GXSXG) que envolve a serina catalítica e é secretada pelo sistema de secreção do tipo I, chamado transportador ABC. In silico, a poliuretanase complexou-se com substratos de cadeia longa, média e curta, confirmando a atividade lipolítica. A poliuretanase exibiu atividade máxima em pH 8,0 e a 30 °C, foi estimulada na presença dos íons Ca 2+ e Ba2+ e inibida pelos íons Zn2+, Cu2+, Fe2+, Co2+, Ni2+ e Mn2+ na concentração final de 10 mM. Na presença de ditiotreitol (DTT), β-mercaptoetanol e dodecil sulfato de sódio (SDS), a atividade da enzima foi aumentada ou pouco influenciada. No entanto, na presença de Tween-80, Triton X-100 e de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), a atividade lipolítica foi inibida. Além disso, dietil pirocarbonato (DEPC) e fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF), na concentração de 10 mM, inibiram completamente a atividade da poliuretanase, mostrando que os resíduos de serina e histidina são importantes para manter a conformação ativa. Este estudo é o primeiro que descreve que S. liquefaciens isolada do leite cru produz uma enzima lipolítica que apresenta estabilidade nas temperaturas de pasteurização, o que pode comprometer a qualidade do leite e seus derivados.