Estudo do envolvimento das proteínas Sl-Gal83 e TCTP na infecção de hospedeiros suscetíveis pelo potyvírus Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) - Cascardo, Renan de Souza (2011)
O genoma da maioria dos vírus que infectam plantas codifica apenas 4-10 proteínas, que são necessárias para completar o ciclo de infecção, incluindo as etapas de replicação do genoma viral, movimento célula-a-célula e movimento sistêmico. Para uma infecção bem sucedida, as proteínas virais devem interagir com fatores do hospedeiro, modulando processos metabólicos e coordenando uma rede complexa de interações bioquímicas e moleculares a favor do patógeno. Uma biblioteca subtrativa foi construída a partir de plantas de tomateiro suscetíveis infectadas pelo potyvírus Pepper yellow mosaic virus (PepYMV). Foram identificados vários genes potencialmente envolvidos nas etapas iniciais do processo de infecção viral. Dentre os genes identificados encontram-se os genes que codificam as proteínas Translationally controlled tumor protein (TCTP) e o homólogo de tomate de Saccharomyces cerevisae Gal83 (Sl-Gal83), uma proteína do complexo Sucrose non-fermenting-1 (SNF1). TCTP é uma proteína altamente conservada em eucariotos, e está envolvida em vários processos celulares básicos, como crescimento celular, progressão do ciclo celular, morte celular programada e proteção contra diversos tipos de estresses. SNF1 desempenha um papel importante na ativação da transcrição e expressão de genes envolvidos na resposta celular aos diferentes tipos de estresses, tais como limitação de nutrientes, salinidade elevada, choque térmico e infecção viral. O objetivo deste trabalho foi estudar o papel das proteínas TCTP e Sl-Gal83 durante o processo de infecção pelo PepYMV em hospedeiros suscetíveis. Plantas transgênicas de tomate cv. Moneymaker silenciadas para estes genes foram produzidas e inoculadas mecanicamente com o PepYMV. O estabelecimento da infecção viral foi avaliado por ELISA e qRT-PCR. Plantas não-transformadas foram infectadas, enquanto as plantas silenciadas permaneceram assintomáticas. Nas plantas silenciadas o ELISA apresentou resultado negativo e a carga viral foi reduzida. A localização subcelular de TCTP em plantas sadias e infectadas pelo PepYMV foi analisada por microscopia confocal utilizando-se uma fusão YFP-TCTP. Em plantas sadias a localização subcelular de TCTP é citoplasmática, conforme descrito para outros organismos. Quarenta e oito horas após a infecção pelo PepYMV, TCTP foi redirecionada para o núcleo. Para determinar qual é a proteína viral que direciona a relocalização de TCTP para o núcleo, cada uma das proteínas virais (P1, HC-Pro, P3, PIPO, P3N-PIPO, CI, 6K2, NIa, NIb e CP) foi coinfiltrada individualmente com pYFP-TCTP. Os resultados mostraram que TCTP acumula predominantemente no núcleo quando co-infiltrada com CI e NIa, e está igualmente distribuída no núcleo e citoplasma, quando co-infiltrada com P1, PIPO, P3NPIPO, 6K2 e NIb. Em plantas co-infiltradas com HC-Pro, P3 e CP, TCTP permaneceu no citoplasma. Para identificar possíveis proteínas virais e/ou do hospedeiro que interagem com TCTP foi realizado um ensaio de purificação por afinidade em tandem. A análise por SDS-PAGE de extratos protéicos de plantas expressando nTAPi-TCTP mostrou duas bandas entre 40 e 50 kDa presentes no extrato purificado. Os fragmentos foram analisados por espectrometria de massa, porém não foi possível identificar as proteínas. Provavelmente o limitante para uma detecção mais eficiente foi a baixa concentração de proteínas eluídas. Com isso, torna-se necessário a otimização do protocolo de extração/eluição para a obtenção de uma maior concentração de proteínas complexadas com nTAPi-TCTP. Em conjunto, os resultados obtidos neste trabalho sugerem que tanto TCTP quanto Sl-Gal83 possuem papéis fundamentais na interação PepYMV-tomate, sendo necessárias para o estabelecimento de uma infecção sistêmica. Estudos adicionais devem ser realizados para melhor compreensão da natureza e dos mecanismos das interações entre TCTP, Sl-Gal83 e o PepYMV.