Análise citológica e perfil de expressão gênica de Hemileia vastatrix (raça XXXIII) na interação com o cafeeiro - Lopes, Rejane do Livramento Freitas (2015)
A raça XXXIII de Hemileia vastatrix foi recentemente identificada no Brasil, infectando algumas cultivares resistentes à ferrugem do cafeeiro. Embora o processo infeccioso de H. vastatrix seja bem estudado, não existem informações acerca da interação de cafeeiros com esta raça do fungo. Diante disso, um dos objetivos deste trabalho foi avaliar o processo de colonização do fungo e as respostas de defesa da planta em genótipos de cafeeiro resistente (Híbrido de Timor – HDT CIFC 832/1) e suscetível (C. arabica cv. Caturra CIFC 19/1) infectados pela raça XXXIII. As primeiras respostas citológicas induzidas pelo fungo foram observadas particularmente nas células estomáticas de ambos os genótipos, às 17 horas após inoculação (hai), e corresponderam à morte celular e ao acúmulo de compostos fenólicos. No genótipo suscetível, o fungo foi capaz de colonizar os tecidos do hospedeiro e produziu um grande número de haustórios, culminando na esporulação cerca de 20 dias após a inoculação (dai). Ao contrário, no genótipo resistente, o crescimento do fungo foi impedido, com alta frequência no estádio pré-haustorial. Estas observações citológicas indicam que a resistência de HDT CIFC 832/1 à raça XXXIII de H. vastatrix é pré-haustorial, ao contrário da resistência pós-haustorial que é geralmente descrita para interações cafeeiro - H. vastatrix. Com base nesta análise, foram definidos os tempos mais adequados para o estudo de genes expressos ao longo do processo infeccioso. Embora o sequenciamento do transcriptoma tenha sido bastante utilizado em estudos de interação planta-patógeno, uma das maiores dificuldades consiste na separação dos transcritos provenientes da planta e do fungo, principalmente quando não existe genoma de referência. Por esta razão, foi realizado o sequenciamento e a montagem do transcriptoma de esporos hidratados e germinados da raça XXXIII de H. vastatrix. A montagem resultou em 32.882 contigs, a partir dos quais foi gerado um conjunto de 11.989 genes preditos. Plantas de C. arabica cv. Caturra Vermelho (CIFC 19/1) e Híbrido de Timor (CIFC 832/1) foram inoculadas com esporos frescos de H. vastatrix (raça XXXIII) para estabelecer uma interação compatível e incompatível, respectivamente. Como controle, foram utilizadas folhas não inoculadas. Nos tempos de coleta pré-definidos (12, 24, 96 horas e 17 dias após a inoculação), as folhas foram removidas e utilizadas para extração de RNA. O sequenciamento das dez bibliotecas de cDNA foi realizado na plataforma Illumina MiSeq, gerando um total de 206 milhões de reads. Após tratamento dos reads, foi realizado o mapeamento das bibliotecas da interação, utilizando como referência o transcriptoma de H. vastatrix previamente montado. Os dados obtidos mostraram que muitos genes de H. vastatrix são similares aos genes do cafeeiro, o que dificulta o estudo da expressão de genes na interação. Por outro lado, genes não conservados entre os dois organismos puderam ser avaliados quanto à sua expressão. Foi verificada a presença de muitos genes comuns às duas interações (compatível e incompatível), sendo que a grande maioria não apresentou expressão diferencial, principalmente nas fases iniciais do processo infeccioso. As maiores diferenças entre as interações foram encontradas aos 17 dai, consistindo principalmente de genes “no hit”, ou seja, genes que não apresentam similaridade com sequências dos bancos de dados de proteínas. Estas sequências podem corresponder a genes específicos de H. vastatrix. As informações geradas nesta pesquisa poderão auxiliar no melhor entendimento da interação entre H. vastatrix e o cafeeiro. O conhecimento dos genes expressos durante a infecção poderá auxiliar no entendimento dos mecanismos moleculares que levam à suplantação da resistência por novas raças do fungo.