Engenharia evolutiva da levedura Kluyveromyces marxianus UFV-3 para fermentação de xilose - Santos, Valdilene Canazart dos (2011)
Kluyveromyces marxianus são leveduras promissoras para a fermentação de glicose e xilose, os principais açúcares presente no hidrolisado de bagaço de cana. No presente trabalho, foi investigado o consumo de xilose em presença de glicose bem como a capacidade de K. marxianus em fermentar várias combinações desses dois açúcares. Células de K. marxianus UFV-3 cultivadas em 20 gL-1 glicose e 20 gL-1 xilose apresentaram um período de adaptação de 30h para o início do consumo da xilose, após a glicose ter sido totalmente consumida. Entretanto, esse período de adaptação não foi observado quando as células foram cultivadas em 5 gL-1 glicose e 20 gL-1 xilose. Nessas condições, as células começaram a consumir xilose logo após a glicose ter sido exaurida do meio. Além disso, foi demonstrado que glicose e xilose podem ser consumidas simultaneamente, quando a respiração é bloqueada. A produção de etanol foi maior quando em mistura de glicose e xilose comparado à glicose sozinha. Por outro lado, K. marxianus UFV-3 não foi capaz de produzir etanol a partir de xilose nas condições avaliadas. Visando selecionar uma linhagem capaz de fermentar xilose, células de K. marxianus UFV-3 foram submetidas à engenharia evolutiva. Mutagênese foi aplicada com o intuito de aumentar a variabilidade genética da população e diminuir o tempo de seleção. Duas técnicas para inserção de mutações aleatórias foram utilizadas: REMI (Integração Mediada por Enzima de Restrição) e radiação ultravioleta (UV). Populações mutantes foram submetidas à seleção em quimiostatos e em bateladas sequenciais. Em quimiostato conduzido sob hipoxia, com uma taxa de diluição de 0.15 h-1 e uma mistura de 5 gL-1 glicose e 10 gL-1 xilose, isolou- se um mutante da população de células submetidas à REMI (KmRhyp). Este isolado produziu 12% mais etanol que a linhagem selvagem, mas com dobro de xilitol. Em batelada sequencial foi isolado um mutante da população irradiada por UV (KmUVsb) capaz de formar etanol de xilose e produzir menor quantidade de xilitol que a linhagem selvagem. Diferenças entre a linhagem selvagem e KmUVsb foram relacionadas a diferenças observadas na atividade de algumas enzimas. A razão entre as atividades específicas da xilitol desidrogenase e da xilose redutase foi maior para a linhagem mutante. As atividades específicas das enzimas da via fermentativa: piruvato descarboxilase e álcool desidrogenase também foram maiores em KmUVsb. Culturas conduzidas em quimiostato limitado por xilose sob condições de aerobiose foram submetidas a um pulso de glicose (50 mmoles.L-1). Nem a linhagem selvagem nem a mutante produziram etanol instantaneamente, confirmando efeito Crabtree-negativo. Etanol foi detectado no sobrenadante após 60 minutos, e a produção deste metabólito foi duas vezes maior na linhagem mutante. Além disso, KmUVsb foi capaz de crescer em anaerobiose estrita na presença de xilose como única fonte de carbono.