Influência de inibidores proteicos e não-proteicos de proteases digestivas e caracterização bioquímico-cinética de cisteíno-proteases parcialmente purificadas de Anticarsia gemmatalis - Mendonça, Eduardo Gomes de (2012)
Os inibidores de proteases têm efeito protetor de plantas contra danos causados por vários tipos de pragas agrícolas, inibindo, significativamente, a atividade proteolítica de enzimas presentes no intestino dos insetos. A ingestão de inibidores de proteases leva os insetos a utilizarem aminoácidos livres na síntese de mais proteases digestivas, com a finalidade de compensar as formas dessas enzimas indisponíveis à catálise, justamente por estas estarem na forma do complexo enzima-inibidor (EI). Consequentemente, ao invés de utilizarem os aminoácidos biodisponíveis para a síntese de proteínas necessárias ao seu crescimento, desenvolvimento, manutenção e reprodução os insetos usam sua reserva aminoacídica para a biossíntese de novas proteases para realizar a hidrólise de sua dieta proteica. A caracterização bioquímica e cinética de enzimas hidrolíticas presentes no intestino de insetos tem sido realizada para se entender o complexo sistema de proteases dos insetos sob o ponto de vista da relação estrutura/função. Dessa forma, os centros ativos de tais enzimas poderão ser mapeados através de cinética enzimática e química de proteínas, com o objetivo de produzir inibidores específicos para cada protease. Neste trabalho foram selecionados os inibidores de proteases SBBI, SKTI e E-64, a fim de avaliar seus efeitos sobre o desenvolvimento larval de Anticarsia gemmatalis e sobre a atividade de algumas enzimas digestivas, tais como proteases totais, serino-proteases tripsinas-like e cisteíno-proteases. Esses inibidores foram adicionados individualmente na dieta artificial na concentração de 0,1% (p/v) e lagartas de 1º ínstar foram alimentadas até completarem seu ciclo larval. Os três inibidores utilizados causaram prejuízo no desenvolvimento de larvas de A. gemmatalis, aumentando o ciclo larval e afetando o ganho de peso dessas larvas até a fase pupal. A concentração de IP s utilizada foi insuficiente para causar efeito inibitório das proteases presentes no intestino de A. gemmatalis. Porém o perfil de proteases coincidiu com o perfil das proteases específicas tripsina-like e cisteíno-proteases, sendo que as serino-proteases apresentaram maior atividade do que as cisteíno-proteases. Foi realizada também a purificação parcial de cisteíno-proteases do intestino médio de Anticarsia gemmatalis utilizando-se precipitação diferencial com 30 60% de (NH4)2SO4 e cromatografia de afinidade com coluna de aprotinina-agarose. As proteínas não ligadas à coluna, ou seja, todas as proteínas presentes no extrato bruto com exceção das serinoproteases ligadas à aprotinina-agarose, que apresentaram atividade proteolítica, foram reunidas num pool enzimático e caracterizadas utilizando o substrato sintético L-BApNA na presença do inibidor de serino-proteases benzamidina. Observaram-se picos de atividade nos valores de pH 4,0, 5,5 e 8,0, sendo o pH 8,0 o de melhor atividade. Com relação à influência da temperatura, observaram-se dois picos mais discretos de atividade a 20ºC e entre 35 45ºC, e um pico de atividade pronunciada na faixa entre 55 60ºC. O KM app obtido foi de 0,74 mM e a Vmax app foi 0,8 M.min-1. A análise do efeito de íons cálcio mostrou que as cisteíno-proteases parcialmente purificadas são cálcio-dependentes e apresentaram melhor atividade em 30 mM de CaCl2. A presença do inibidor de serino-proteases benzamidina e do agente redutor DTT no meio reacional, juntamente com os dois inibidores de serino-proteases aprotinina e TLCK comprovam a atividade de cisteíno-proteases testadas no presente trabalho.