Caracterização em escala genômica de fitases fúngicas, otimização da produção e expressão da fitase de Talaromyces pinophilus - Ferreira, Roberta Corsino (2019)
Os alimentos de origem vegetal utilizados nas rações para animais possuem ácido fítico ou fitato, um fator antinutricional, devido à sua capacidade de se ligar a cátions e macromoléculas impossibilitando a absorção desses nutrientes pelos animais. Os animais não ruminantes não sintetizam ou produzem níveis insuficientes de fitase, enzima capaz de catalisar a hidrólise do fitato. Sendo assim, objetivou-se avaliar o potencial de fungos fitopatogênicos e habitantes de solo de expressão e secreção de fitases com potecial para aplicação biotecnológica na produção de ração. Dessa forma, foram selecionados doze fungos, entre ascomicetos e basidiomicetos, para uma caracterização em escala genômica por meio de uma predição in silico das sequências dessas enzimas. Cinquenta sequências com potencial de hidrólise do fitato foram identificadas, sendo que, trinta são classificadas como fitases pertencentes às famílias beta-hélice e das fosfatases ácidas de histidina, possibilitando o entendimento da identidade enzimática, mostrando as diferenças entre estas famílias de fitase. Os resultados sugerem que, além das fitases pertencentes à família das fosfatases ácidas de histidina, alguns fungos ascomicetos selecionados podem secretar fitases da família beta-hélice. Entre os microrganismos estudados, o fungo Talaromyces pinophilus foi selecionado para a otimização produção de fitase por meio da metodologia de superfície de resposta, utilizando casca de soja como substrato. Pela metodologia de superfície de resposta foi possível otimizar a produção da fitase pelo T. pinophilus, se mostrando uma ferramenta fundamental nesse processo ao fornecer modelos matemáticos confiáveis. A concentração de peptona e o tempo de cultivo foram os fatores que possuiram maiores efeitos nas atividades enzimáticas, tanto em U/mL como em U/mg. Enquanto a presença do cloreto de cálcio no meio promoveu uma redução na atividade. Os códons otimizados do gene 7227 do fungo T. pinophilus foram clonados e expressos em sistema heterólogo em P. pastoris. A espectrometria de massa foi utilizada para identificação da proteína recombinante confirmando a expressão. A enzima recombinate do clone 2 apresentou melhor atividade específica com 36 h de cultivo, temperatura ótima de 55° C em pH 6,0 e permaneceu estável em diferentes valores de pH (3,0-6,0), demonstrando potencial para aplicação na indústria de rações.