Mapeamento físico de rDNA 5S em Eucalyptus dunnii Maiden e Zea mays L. pela técnica de PRINS - Sattler, Mariana Cansian (2017)
A detecção de sequências de DNA in situ por meio de técnicas de citogenética molecular consiste em uma das metodologias mais utilizadas para o mapeamento físico. Embora seja amplamente aplicada na pesquisa genômica, a Hibridização Fluorescente In Situ (FISH - Fluorescent In Situ Hybrid/zation) tem sido considerada uma técnica relativamente demorada, uma vez que requer a construção de uma sonda marcada. A Reação de Amplificação In Situ (PRINS Primed ln situ Label/ing), por sua vez, consiste em uma alternativa sensível e rápida em relação a FISH. No entanto, a especificidade e sensibilidade da técnica de PRINS podem ser influenciadas por fatores especie-específicos. Desse modo, o presente estudo teve como objetivo adaptar um protocolo de PRINS reprodutível para o mapeamento físico de genes de rRNA 58 em duas espécies com cromossomos de tamanhos relativamente diferentes: Eucalyptus dunnii Maiden e Zea mays L. Inicialmente, meristemas radiculares de ambas as espécies foram sincronizados com hidroxiureia e tratados com o agente anti- tubulínico amiprofos-metil para o acúmulo de metáfases. Em seguida, os meristemas foram submetidos a maceração enzimática e as lâminas confeccionadas pelas técnicas de dissociação celular e secagem ao ar. Após o pré-tratamento das lâminas, um par de primers específicos para a região 58 de E. glóbulus foi utilizado para a reação de PRINS, que consistiu de um único ciclo. A reação foi conduzida em preparações de E. dunnii e Z. mays contendo cromossomos metafásicos morfologicamente preservados, sem resíduos de citoplasma ou sobreposições. A técnica de FISH foi adicionalmente aplicada na espécie Z. mays com o intuito de confirmar os resultados obtidos pela PRINS. O mesmo par de primers foi utilizado para a construção de sondas marcadas com fluorescência, as quais foram posteriormente hibridizadas com o DNA alvo. Os cariótipos de E. dunnii e Z. mays exibiram 2n = 2x = 22 e Zn = 2x = 20 cromossomos, respectivamente. Em ambas as espécies, o cromossomo portador da constrição secundaria foi classificado como o número 6. O protocolo de citogenética clássica associado a reação de PRIN8 resultou em sinais nítidos para a sequência de rDNA 58 tanto em núcleos interfásicos quanto em cromossomos metafásicos de E. dunnii e Z. mays. Em E. dunnii, os genes de rRNA 58 foram mapeados no braço curto do cromossomo 5, em posição pericentromérica. Na espécie Z. mays, o sinal foi localizado na região terminal do braço longo do cromossomo 2. A técnica de FISH confirmou o resultado obtido pela PRIN8 nessa especie. Embora o tamanho dos cromossomos possa influenciar na resolução de técnicas de citogenética molecular, o protocolo descrito resultou em uma elevada razão sinal:background para ambas as espécies estudadas, evidenciando sua reprodutibilidade. Esse estudo consiste no primeiro relato do mapeamento de sequências específicas em E. dunnii e Z. mays pela PRIN8, contribuindo para o desenvolvimento e aperfeiçoamento das técnicas de mapeamento físico em espécies vegetais. Além disso, a localização dos genes de rDNA 58 ainda não se encontra disponível no mapa de ligação ou no genoma sequenciado de Eucalyptus. Dentro desse contexto, a localização física das sequências de rDNA 58 de E. dunnii pode ser integrada aos dados de sequenciamento e auxiliar no alinhamento de sequencias e posicionamento dos genes de rDNA 58 no genoma sequenciado.