Caracterização, distribuição e estudo da atividade de elementos transponíveis em Crinipellis perniciosa, agente causal da vassoura-de-bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao) - Pereira, Jorge Fernando (2005)
Neste trabalho, elementos transponíveis da Classe I e da Classe II foram caracterizados no genoma do fungo Crinipellis perniciosa, agente causal da enfermidade conhecida como vassoura-de-bruxa no cacaueiro. C. perniciosa apresenta uma alta variabilidade genética e elementos transponíveis têm sido relatados como um dos principais agentes responsáveis pela alta plasticidade e adaptabilidade apresentada por fungos fitopatogênicos. Buscas preliminares feitas no banco de dados do Projeto Genoma da Vassoura-de-Bruxa revelaram a presença de uma seqüência de DNA com similaridade a transcriptase reversa de elementos da Classe I pertencente ao grupo gypsy/Ty3. Esta seqüência foi amplificada em diferentes isolados de C. perniciosa que pertencem aos biótipos C, S e L e distintas regiões geográficas. Seqüenciamento de fragmentos amplificados revelaram a ocorrência de vários eventos de transição G:C para A:T, indicando a existência de um possível mecanismo de silenciamento tipo RIP. Análises de hibridização mostraram a presença de um alto número de cópias da região que codifica a transcriptase reversa e diferentes perfis de hibridização nos isolados dos biótipos C, S e L, indicando que os elementos que contém estas seqüências podem ter um importante papel na variabilidade de C. perniciosa. O fragmento de DNA contendo a seqüência de transcriptase reversa foi utilizado para o isolamento de fagos recombinantes em um banco genômico de C. perniciosa. Retrotransposons do grupo gypsy/Ty3, denominados CpSaci1 e CpSaci2, foram caracterizados a partir de uma nova seqüência presente no banco de dados do Projeto Genoma da Vassoura-de- Bruxa e de um dos fagos recombinantes obtidos. CpSaci1 possui 6.856 pares de bases (pb) e contém longas repetições terminais (LTRs) diretas de 423 pb que não apresentam regiões normalmente encontradas em LTRs de retrotransposons. Duas seqüências de leitura aberta (ORFs) foramidentificadas codificando peptídeos similares à GAG e à poliproteína POL contendo os domínios protease, transcriptase reversa, RNase H e integrase. A seqüência de DNA de CpSaci2, que foi parcialmente caracterizada, possui cerca de 82% de identidade com CpSaci1. Estas duas cópias apresentam inserções de bases e códons de parada na região estrutural indicando que se tratam de cópias inativas. Entretanto, análises por RT-PCR revelaram a presença de transcritos CpSaci normalmente expressos em C. perniciosa cultivado em meio mínimo, e que, sob condições de estresse nutricional, apresentaram uma maior expressão. CpSaci está presente em alto número de cópias no genoma dos biótipos C, S e L de C. perniciosa, sendo que isolados do biótipo C originados do estado da Bahia apresentam dois perfis de hibridização, e alguns fragmentos de DNA em comum com isolados da região amazônica. Por possuir alto número de cópias e ser ativo, o retrotransposon CpSaci provavelmente está relacionado com a geração de variabilidade genética em C. perniciosa. Além do retrotransposon CpSaci, elementos transponíveis da Classe II também foram caracterizados. As cópias denominadas Boto1 e Boto2 foram obtidas a partir do banco de dados do Projeto Genoma da Vassoura-de-Bruxa e a partir de um fago recombinante isolado de um banco genômico de C. perniciosa, respectivamente. Boto1 é flanqueado por uma duplicação de 3 pb (TAA) e possui duas ORFs, uma que codifica uma transposase e outra que codifica uma proteína com baixa similaridade a um regulador da transcrição de plantas. As regiões estruturais que codificam as transposases de Boto1 e Boto2 são interrompidas por um intron de 53 pb com alto conteúdo A+T. As transposases de Boto1 e Boto2 são altamente similares à transposases de elementos PIF-like. Estas transposases são relacionadas à transposases de seqüências de inserção do grupo IS5 de bactérias e fazem parte de uma nova família de transposons da Classe II denominada PIF/IS5. A superfamília PIF/IS5 é raramente encontrada em fungos, e como análises filogenéticas indicam que as transposases Boto-like formam um ramo evolutivo independente, estas seqüências parecem ter sido transferidas horizontalmente para o genoma de C. perniciosa. Transcritos Boto- like foram amplificados por RT-PCR em C. perniciosa normalmente cultivado em meio de cultura, mas não foram ativados por estresse nutricional. Este é o primeiro relato de elementos da superfamília PIF/IS5 em um fungo fitopatogênico.