Sistemas de recuperação de ribossomos em Actinobacillus pleuropneumoniae: papel em virulência e resposta a diferentes condições de estresse - Teixeira, Ana Carolina Nery (2018)
A pleuropneumonia suína é uma doença respiratória causada pelo patógeno bacteriano Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) cujo sucesso na colonização e permanência nos pulmões do suíno está relacionado à sua capacidade de resistência a diferentes condições de estresse e a inúmeros fatores de virulência. Para o sucesso do patógeno, a síntese proteica eficiente é um gargalo, uma vez que este processo pode ser um fator limitante durante o crescimento e replicação bacterianos, e para isso há uma expressiva necessidade de ribossomos ativos dentro da célula. Em condições de estresse, os ribossomos podem ficar parados em uma fita de mRNA quando um códon de parada não é detectado, precisando, portanto, de um resgate ativo em um processo chamado trans-tradução. Um RNA pequeno denominado tmRNA, ubíquo em bactérias, codificado pelo gene ssrA, é responsável por mediar o mecanismo de trans-tradução. Muitas bactérias ainda apresentam dois sistemas adicionais mediados pelo fator de resgate alternativo A (alternative rescue factor A), ArfA, descrito em outras bactérias como Escherichia coli, Salmonella enterica e Yersinia pestis e o fator de recuperação alternativo B (alternative rescue factor B), ArfB presente em 34% dos genomas bacterianos já sequenciados. Este trabalho teve como objetivos investigar qual(is) sistema(s) de recuperação de ribossomos está(ão) presente(s) em A. pleuropneumoniae e qual o envolvimento deste(s) na virulência e na resposta a diferentes condições de estresse. Análises in silico e in vitro foram conduzidas com este propósito. Nossos resultados in silico mostraram que A. pleuropneumoniae possui apenas dois sistemas de recuperação de ribossomos, e o fato de não conseguirmos a obtenção de uma linhagem duplo mutante (∆ssrA_∆arfA) valida nosso resultado. Para verificar o envolvimento destes genes em virulência e resposta a condições de estresse, linhagens mutantes denominadas ∆ssrA e ∆arfA, bem como linhagens complementadas para as respectivas linhagens, ∆ssrAC e ∆arfAC, respectivamente, foram construídas a partir da linhagem APP MIDG2331 WT (sorotipo 8). Estas linhagens (WT, mutantes e complementadas) foram investigadas quanto ao crescimento in vitro, adesão, sensibilidade a antibióticos e a diferentes condições de estresse (oxidativo, osmótico, temperatura e etanólico). Além disso, a virulência destas linhagens foi analisada no modelo de infecção alternativo Galleria mellonella. Análises fenotípicas mostraram que o mutante ∆ssrA foi mais sensível antibióticos e a todas as condições de estresse se comparado à linhagem WT e ao mutante ∆arfA. Além disso, o mutante ∆ssrA apresentou menor capacidade de adesão e virulência atenuada em G. mellonella quando comparada com as linhagens WT e ∆arfA. A linhagem ∆ssrAC não mostrou uma restauração completa do fenótipo original. Entretanto, a linhagem ∆arfAC mostra uma restauração completa do fenótipo. Estes resultados mostram que o gene ssrA tem um papel importante na resistência ao estresse e na virulência em APP e a ausência do gene arfA não afetou o fitness da bactéria nas condições avaliadas. Diante desses resultados, podemos concluir que o sistema TmRNA/SmpB é o principal sistema de recuperação de ribossomos em A. pleuropneumoniae e que a falta do mesmo acarreta em atenuação do fenótipo de virulência e aumento da sensibilidade a condições de estresse.