Morfogênese in vitro de urucum (Bixa orellana L.) - Paiva Neto, Vespasiano Borges de (2002)
Bixa orellana L. (Bixaceae) é uma espécie lenhosa conhecida como urucum e que, recentemente, tem despertado o interesse da indústria cosmética e alimentícia por acumular em suas sementes um corante natural, constituído basicamente pelos carotenóides bixina e norbixina. O urucum possui elevada taxa de polinização cruzada, e sendo propagado basicamente via sementes, os plantios comerciais apresentam marcante heterozigose. Por isso, a aplicação de um sistema eficiente de propagação in vitro pode ajudar na multiplicação de ‘tipos elite’, em especial aqueles com elevado teor de carotenóides. Além disso, a propagação in vitro é fundamental para o desenvolvimento de protocolo de transformação genética visando maior acúmulo dos carotenóides nas sementes mediante a superexpressão de enzimas relacionadas à rota biossintética desses compostos. Objetivando estabelecer protocolo de regeneração in vitro de urucum, diferentes explantes [hipocótilos invertidos (HI) e segmentos de hipocótilo (SH)] obtidos de plântulas germinadas in vitro, e embriões zigóticos imaturos foram inoculados em meio MS suplementado com diferentes concentrações de reguladores para obtenção de organogênese e embriogênese somática, respectivamente. Dentre os fatores avaliados, a melhor combinação para obtenção de organogênese consistiu de inoculação de hipocótilos invertidos em meio MS suplementado com 4,56 μM Zea, 87,6 mM sacarose e 2,8 g dm -3 Fitagel ® . A utilização de TDZ não resultou em brotações alongadas, embora tenha ocorrido a formação de multibrotações, enquanto que BAP resultou em resposta intermediária. TDZ induziu intensa divisão mitótica, resultando na formação de inúmeras zonas de proliferação localizadas próximas à epiderme e tecido cortical periférico. A melhor resposta para enraizamento das brotações adventícias alongadas foi obtida com 5,0 μM AIB, apesar da presença indesejável de calos. A obtenção de embriogênese somática só foi possível a partir de embriões zigóticos imaturos e quando carvão ativo estava presente no meio, independente da presença de regulador de crescimento. Apesar disso, a presença de 2,4-D e/ou cinetina acelerou a obtenção de embriões somáticos. A ausência de carvão ativo determinou calogênese e posterior embriogênese somática indireta. Embriões somáticos primários diretos originaram-se preferencialmente das camadas de tecidos externos do explante, como protoderme e meristema fundamental. No entanto, evidenciou-se que a indução de embriogênese somática em urucum pode ser afetada pelo genótipo e explante. Em outro experimento, verificou-se a possibilidade de utilização do carboidrato manose na seleção de plantas de urucum transformadas com o gene fosfomanose isomerase (PMI). Para isso, HI e SH, e embriões somáticos imaturos foram inoculados em meio MS com os melhores fatores para indução de organogênese e embriogênese somática, respectivamente, sendo que a sacarose do meio parcial ou totalmente substituída por manose, a fim de obter a curva de morte dos explantes. Desta forma, observou-se que o urucum foi incapaz de regenerar brotações adventícias na presença de manose como única forma de carbono, ou ainda de formar embriões somáticos quando até 25% da manose foi substituída por sacarose. Assim, o urucum pode ser transformado usando manose como agente seletivo em substituição aos agentes seletivos convencionalmente usados (herbicidas e antibióticos). Para verificar a influência do etileno no enraizamento de brotações de urucum in vitro, ápices caulinares, excisados de plântulas de urucum obtidas a partir da germinação de sementes in vitro, foram inoculados em meio MS básico (controle) ou suplementado com 5 μM AIB ou ANA isolados, ou em combinação com um inibidor (AVG) ou promotor (ACC) da síntese de etileno. Os resultados obtidos mostraram que o uso das auxinas AIB e ANA aumentou a freqüência de enraizamento e o número médio de raízes adventícias por brotação, e concomitantemente aumentou a biossíntese de etileno e a presença indesejável de calos nos tecidos epidérmico e cortical da extremidade proximal das brotações. Análises histológicas revelaram, ainda, a origem das raízes adventícias a partir dos parênquimas do floema e,ou, xilema secundários. No entanto, AVG adicionado ao meio de enraizamento controlou a biossíntese de etileno e a indução de calos na extremidade proximal de ápices caulinares de urucum, mantendo inalterados a epiderme, córtex e demais tecidos internos. Por outro lado, ACC aumentou a freqüência de enraizamento, retardou o enraizamento e aumentou o calejamento quando comparado ao tratamento controle, resultando em intensa proliferação celular predominantemente nos tecidos cortical e vascular, enquanto a epiderme tornou-se extremamente alterada. Finalmente, após uma ampla revisão de literatura, e tendo em vista a importância da fonte de carbono nos processos morfogênicos, e o aumento do uso de novos genes seletivos baseados na fonte de carbono, como por exemplo, o gene fosfomanose isomerase, supõe-se que a padronização da concentração molar como referência para comparar diferentes fontes de carbono é preferível à concentração percentual, comumente utilizada. Essa padronização, juntamente com maior criticismo em relação aos dados encontrados na literatura, irão contribuir positivamente a fim de evitar a perpetuação de erros na elaboração de tratamentos envolvendo diferentes suplementações de açúcares ao meio de cultivo.