Caracterização de protease e lipase de Pseudomonas fluorescens e quorum sensing em bactérias psicrotróficas isoladas de leite - Martins, Maurilio Lopes (2007)
Protease e lipase produzidas por Pseudomonas fluorescens foram purificadas e caracterizadas. Os genes aprX e lipM foram clonados, seqüenciados, e expressos em Escherichia coli e apresentaram alta identidade com as seqüências disponíveis no banco de dados. A massa molecular deduzida de ambas as enzimas foi de 50 kDa. Foi verificado que cálcio é essencial para as atividades enzimáticas, uma vez que quando este íon não foi adicionado à solução de diálise nenhuma atividade foi encontrada. A protease foi ativa em ampla faixa de pH, apresentou temperatura ótima de 37 °C, e maior atividade foi verificada sobre caseína e gelatina. Maior estabilidade térmica da enzima foi a 75 °C por 20 s. A lipase foi mais ativa a 25 °C e em pH próximo de 7,5 e p-nitrofenil-palmitato foi o substrato preferencial. Tratamentos térmicos de 65 °C por 30 min e de 75 °C por 1 min reduziram sua atividade para 13,2% e 25,4%, respectivamente. O mecanismo de quorum sensing (QS) em P. fluorescens foi estudado e verificou-se que as estirpes avaliadas, apesar de induzirem Agrobacterium tumefaciens NTL4 e A136, não produziram acil homoserinas lactonas (AHLs). Entretanto, a produção de auto-indutor dois (AI-2) foi detectada e a presença de dicetopiperazinas (DKPs) nos extratos químicos obtidos a partir de meio TYEP inoculado com P. fluorescens foi constatada. O rDNA 16S de seis bactérias gram-negativas isoladas de leite cru foi seqüenciado e o isolado 039 foi identificado como Pantoea sp., 059, 068 e 071 foram identificados como Hafnia alvei, 067 como Enterobacter sp. e 099 como Aeromonas hydrophila. Verificou-se que esses isolados apresentam diferenças no potencial deteriorador, na resistência a antibióticos e, após ensaios de estria cruzada em superfície de meio sólido para detecção de AHLs, constatou-se que somente Pantoea sp. não foi capaz de induzir nenhuma das estirpes monitoras utilizadas. Os ensaios de cromatografia em camada fina e a caracterização química dos extratos por espectrometria de massa confirmaram que essas bactérias produzem diferentes AHLs. O mecanismo de inibição de quorum foi utilizado e a enzima lactonase foi expressa em Enterobacter sp. transconjugante a qual foi incapaz de acumular AHLs em sobrenadante de caldo LB. O transconjugante se mostrou mais proteolítico do que a estirpe selvagem, indicando que o mecanismo de QS regula negativamente a atividade proteolítica neste isolado. Das 32 enzimas de restrição utilizadas para restringir o plasmídeo nativo (pMLM) presente nos isolados de H. alvei 068 e 071, apenas DdeI, HinfI, MspI, e RsaI foram efetivas. Além disso, não foi possível expressar a enzima lactonase em H. alvei 068 e 071 transconjugantes o que impossibilitou a avaliação da influência do mecanismo de QS sobre a atividade proteolítica desses isolados. O gene halI, que codifica a sintase de AHLs produzidas por estirpes de H. alvei, foi identificado nos isolados 059, 067, 068 e 071. Esse gene foi clonado, seqüenciado e expresso em E. coli e verificou-se que codifica uma sintase responsável pela produção de N-hexanoil-DL-homoserina lactona (C6-HSL) e N-3-oxohexanoil-L-homoserina lactona (3-oxo-C6-HSL). Das seis estirpes psicrotróficas proteolíticas avaliadas, apenas A. hydrophila foi capaz de produzir quitinase, AI-2 e de ser patogênica contra Caenorhabditis elegans.