Complexo celulolítico e hemicelulolítico do fungo endofítico Fusarium verticillioides e sua aplicação para sacarificação do bagaço de cana. - Almeida, Maíra Nicolau de (2013)
Neste trabalho o fungo endofítico Fusarium verticillioides foi avaliado quanto ao seu potencial para produção de enzimas celulases e hemicelulases visando sua aplicação no processo de sacarificação da biomassa para produção de etanol. O meio de cultivo utilizado para produção de celulases e xilanase por F. verticillioides foi otimizado. Níveis ótimos de fonte de carbono (palha de milho), fonte de nitrogênio (nitrato de sódio) e tempo de cultivo foram determinados. As atividades de endoglicanase e xilanase aumentaram de 2,8 U/mL para 8,0 U/mL e de 3,4 U/mL para 114,0 U/mL, respectivamente. Temperatura e pH ótimos foram determinados para endoglicanse (5,6; 80 °C), celobiase (5,6; 60 °C), FPase (6,0; 55 °C) e xilanase (7,0; 50 °C). O extrato enzimático otimizado foi usado na sacarificação e fermentação simultâneas de bagaço de cana. Neste processo 9,7 g/L de etanol foram obtidos com um rendimento de etanol/ biomassa (g/g) de 0,19. Um segundo meio de cultivo contendo diferentes fontes de nitrogênio (ureia, extrato de levedura, peptona e sulfato de amônio) e forrageira como fonte de carbono foi estabelecido por meio de delineamento de Plackett Burman para produção de celulases. Dois meios contrastantes, M1 e M2, foram definidos para maior produção de endoglicanase e celobiase, respectivamente. Misturas destes dois extratos foram testadas para a sacarificação do bagaço de cana e o extrato M1 apresentou o maior rendimento para conversão de glicanas 26,6 %, e de xilanases 40,4 %. Dosagens diferentes de proteína (10 mg/g, 20 mg/g e 40 mg/g de biomassa seca) do extrato M1 foram avaliadas em relação à sacarificação de bagaço de cana. Rendimentos de 43,4 % e 73,1 % foram observados para conversão de glicanas e xilanas, respectivamente quando 40 mg/g foi utilizado. Adsorção de proteína foi observada durante a sacarificação o que pode explicar a observada diminuição da produtividade durante o processo de sacarificação. O fungo F. verticillioides e o fungo Acremonium zeae foram avaliados em relação as suas capacidades de fermentação de açúcares simples e de biomassa lignocelulósica. Fusarium verticillioides produziu etanol a partir de glicose, xilose e de uma mistura dos destes dois açúcares com rendimentos de 0,47 g/g, 0,46 g/g e 0,50 g/g de etanol por açúcar utilizado. O fungo Acremonium zeae produziu etanol a partir de glicose, xilose e da mistura com rendimento de 0,37 g/g, 0,39 g/g e 0,48 g/g de açúcar utilizado. Os dois fungos foram capazes de co-fermentar glicose e xilose. Fusarium verticillioides e A. zeae produziram altas atividades de endoglicanase e de xilanase utilizando bagaço de cana como fonte de carbono. A produção de etanol a partir de 40 g/L de bagaço de cana foi de 4,6 g/L e 3,9 g/L para F. verticillioides e A. zeae, respectivamente. Grande interesse foi gerado pelas características bioquímicas da atividade de endoglicanase, como atividade em temperaturas elevadas e estabilidade em diversos pHs. Assim, foi desenvolvido um estudo de purificação e caracterização da atividade de endoglicanase do fungo F. verticillioides. Um complexo multienzimático, E1C, e uma endoglicanase livre, E2, foram purificados. O complexo E1C contém duas endoglicanases (GH3 e GH10), uma celobiohidrolase (GH7) e uma xilanase (GH10). A temperatura de máxima atividade foi 80 °C para E1C e para E2. A enzima livre e o complexo foram termoestáveis a 50 °C e 60 °C. A energia de ativação para E1C e E2 foram 21,3 KJ/mol e 27,5 KJ/mol, respectivamente. Atividade máxima de E1C foi em pH 4,5 e de E2 foi em pH 5,5; E1C apresentou alta estabilidade após 24 h de préincubação em pHs variando de 2,6 a 8,0. O valor de KM para E1C foi 10,25 g/L enquanto para E2 foi 6,58 g/L usando carboximetilcelulose como substrato. Tanto E1C quanto E2 foram significativamente ativadas por Mn2+, CoCl2, furfural, hidroximetilfurfural and ditiotreitol enquanto foram inibidas por SDS, CuSO4, FeCl3, AgNO4, ZnSO4 e HgCl2. O complexo E1C e a enzima livre E2 apresentaram atividade mais alta utilizando o substrato glicana de cevada (Barley-β-glucan) do que utilizando o substrato padrão carboxymetilcelulose (CMC), indicando atividade de endo-β-1,3-1,4-glicanase. As enzimas foram capazes de hidrolisar celopentaose, celotetraose e celotriose, entretanto com modos de ação diferentes. Em todos os ensaios que avaliavam estabilidade e eficiência, E1C apresentou melhores resultados do que E2, o que sugere vantagens geradas pela interação física de proteínas presente nos complexos.