Embriogênese somática em Brachypodium distachyon (L.) Beauv. (Poaceae): caracterização morfoanatômica, histoquímica e expressão de genes SERK - Oliveira, Evelyn Jardim de (2013)
Brachypodium distachyon (L.) P. Beauv. (Poaceae: Poideae) tem se destacado como planta modelo para gramíneas de clima temperado e espécies usadas para a produção de biocombustíveis. A linhagem Bd21 de Brachypodium distachyon tem um genoma completamente seqüenciado e montado, além de protocolos de genômica e de transformação bem estabelecidos com base em calos embriogênicos. No entanto, as informações sobre a origem e as alterações celulares que ocorrem durante a diferenciação de embriões somáticos nos estágios iniciais não foi documentada para B. distachyon. Também não há relatos sobre o uso de abordagens moleculares para investigar o processo de embriogênese somática nesta espécie. Portanto, os objetivos deste trabalho foram: (1) caracterizar as alterações morfológicas, anatômicas e histoquímicas que ocorrem durante a indução de embriogênese somática a partir de embriões zigóticos imaturos (EZI) da B. distachyon linhagem de referência Bd21 usando microscopia de luz e de varredura em associação com testes histoquímicos e, (2), realizar a clonagem e caracterização de genes SERK (SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE) e analisar sua expressão na indução de embriogênese somática utilizando hibridização in situ para monitorar os processos morfogenéticos in vitro. Culturas embriogênicas de B. distachyon (BD21) foram estabelecidas usando EZI 15 dias após a antese, em meio Murashige e Skoog (1962) contendo ácido 2,4- diclorofenoxiacético. A regeneração in vitro de plântulas derivadas de embriões somáticos ocorreu pela embriogênese somática através da via indireta. Os embriões somáticos tiveram uma origem multicelular e originaram-se de calo embriogênico formado a partir de células da epiderme na região do nó escutelar que se estenderam para a periferia do EZI. A ordem de acumulação de reservas nos embriões somáticos foi semelhante a dos embriões zigóticos. Nas culturas embriogênicas, proteínas e lipídios foram utilizados nos primeiros 2 dias em meio de indução. O teor de amido aumentou nos primeiros 2 dias em meio de indução e diminuiu em seguida em número de grânulos que se tornaram maiores e apareceram principalmente nas células vacuoladas adjacentes às massas pró-embriogênicas. Pequenos grânulos de amido começaram a acumular nos pró-embrioides após 4 dias em meio de indução e tornaram- se maior e mais abundantes em células do escutelo aos 12 dias em meio de indução. A diferenciação do embrião somático seguiu a mesma sequência de desenvolvimento verificado em outros membros da família Poaceae, ou seja, a passagem pelos estádios globular, escutelar e coleoptilar. O gene SERK tem sido usado como um marcador para as células competentes na embriogênese somática de várias espécies. Neste estudo, utilizando iniciadores degenerados, uma sequência específica homóloga de um fragmento do gene SERK foi amplificada de B. distachyon Bd21. A análise da sequência do fragmento de SERK (766 bp) revelou altos níveis de similaridade com genes SERK relatados em outras espécies. A análise de hibridização in situ mostrou que o gene SERK estava presente nos tecidos embriogênicos de B. distachyon antes do desenvolvimento de embriões somáticos e continuou sendo expresso nos estágios globular e escutelar. Estes resultados sugerem que a expressão do gene SERK de B. distachyon pode estar associada com a indução da embriogênese somática. Este estudo faz a primeira descrição de mudanças morfoanatômicas e histoquímicas durante o processo de embriogênese somática em B. distachyon linhagem Bd21. Este é também o primeiro relato sobre a clonagem e expressão de um gene SERK para a espécie e sugere que este gene pode servir como um marcador molecular para monitorar a transição de células somáticas em células competentes e embriogênicas também em B. distachyon.