Morfogênese in vitro e transformação genética de citros mediada por Agrobacterium tumefaciens - Oliveira, Maria Luiza Peixoto de (2008)
Os protocolos utilizados para transformação genética de citros têm resultado numa baixa eficiência de transformação, com obtenção de pequeno número de plantas transgênicas, além de utilizarem material juvenil como fonte de explantes necessitando de um longo período para frutificação e conseguinte avaliação de uma característica de interesse introduzida. Um protocolo ideal para a transformação de citros seria baseado na utilização de tecido adulto como fonte de explantes, que reduziria o longo período de juvenilidade, e abreviria o tempo para a análise da característica transgênica incorporada. O objetivo inicial do presente trabalho foi o estabelecimento de um sistema de regeneração in vitro a partir de segmentos internodais de plantas adultas de três variedades de laranja doce (Citrus sinensis L. Osb.) e limão Cravo (Citrus limonia Osb.), visando à otimização da metodologia de transformação. Para a indução de organogênese, investigamos diferentes meios de cultura associados a reguladores de crescimentos (BAP e ANA) e antibióticos β- lactâmicos (timentim, cefotaxima, meropenen e augmentina), utilizados na supressão do crescimento bacteriano e na resposta morfogênica de tecidos adultos de C. sinensis e C. limonia. Demonstrou-se que a indução in vitro de brotações em tecidos adultos de citros foi afetada pelo genótipo, reguladores de crescimento, formulação do meio e a pela incorporação de antibióticos no meio de cultura. Além disso, foram adequados protocolo otimizados para a transformação genética de segmentos de epicótilo e cotilédones imaturos via Agrobcaterium tumefaciens. Para a otimização do protocolo envolvendo explantes provenientes de segmentos de epicótilo, alguns fatores foram investigados, como; o uso de sonicação, infiltração a vácuo e sonicação associada com infiltração a vácuo, comparando-se ao método tradicional de transformação envolvendo Agrobacterium (co- cultivo ou imersão na solução bacteriana) durante o co- cultivo de explantes de laranja doce Pineapple , e citrumelo Swuingle . A utilização de sonicação por 2 segundos, seguidos por 10 minutos de infiltração a vácuo, teve efeito positivo na eficiência de transformação (8.4%) para laranja Pineapple . Para citrumelo Swuingle a eficiência de transformação também foi aumentada com a combinação de sonicação e infiltração a vácuo (9,6%), mas não foi suficiente para obter uma percentagem maior que a utilização somente da metodologia tradicional de co-cultivo, com eficiência de transformação de 11,2%. Finalmente, estudou- se fatores que pudessem influenciar o processo de indução da morfogênese e a eficiência de transformação em cotilédones imaturos de grapefruit Duncan . Para a indução da organogênese a combinação de 2 mg l-1 BAP, 1 mg l-1 KIN and 1 mg l-1 AIA promoveu a maior freqüência de cotilédones produzindo brotações (96%) e número de brotações por explante (5,8), utilizando explantes cultivados dorsalmente em contato com o meio de cultura por 3 semanas no escuro, seguido por mais 3 semanas em regime de 16/8 horas (luz/ escuro). Os parâmetros analisados para aumentar a eficiência de transformação mediada por Agrobacterium resultaram em uma alta eficiência de transformação obtida quando os expantes foram submetidos a 15 minutos de infiltração a vácuo em presença da Agrobacterium (OD600nm 0,5), co- cultivados por 3 dias em meio contendo 100 μM de acetoseringona e transferidos para meio de seleção, constituído do meio MS contendo 30 mg l-1 de canamicina, 12,5 mg l-1 de meropenen, 2 mg l-1 BAP, 1 mg l-1 KIN and 1 mg l-1 AIA.