Influência das fontes de carbono na indução de celulases e hemicelulases em Chrysoporthe cubensis cultivado em meio líquido - Dutra, Thiago Rodrigues (2013)
Resultados recentes obtidos em nosso grupo de pesquisa (Produção e Caracterização de Enzimas de Interesse Biotecnológico) têm demonstrado que Chrysoporthe cubensis, fungo patógeno de eucalipto, possui potencial para produção de enzimas para a sacarificação da biomassa lignocelulósica. Neste estudo o fungo foi cultivado em diversas fontes de carbono sob condições submersas, a fim de observar a produção de celulases e hemicelulases extracelulares. Foram testados como indutores de atividade enzimática fontes de carbono complexas como farelo de trigo, carboximetilcelulose CMC, xilana Birchwood XB, Locust bean gum LBG, pectina de citrus peel CP e também fontes de carbono mais simples como glicose, celobiose, lactose, galactose, manose, xilose e arabinose. C. cubensis produziu os maiores níveis de atividades celulolíticas e hemicelulolíticas quando crescido em farelo de trigo e CMC. Quando cultivado em farelo de trigo C. cubensis produziu as atividades β-glicosidase, endoglicanase e xilanase de 0,36 U/mL, 3,6 U/mL, 14,2 U/mL, respectivamente. Quando cultivado em CMC, C. cubensis produziu atividades de β-glicosidase, endoglicanase e xilanase de 0,48 U/mL, 2,8 U/mL, 10,7 U/mL, respectivamente. Quando C. cubensis cresceu em xilana birchwood apresentou atividade de xilanase de 9,9 U/mL, porém não foi eficaz na produção de celulases. Fontes de carbono simples apresentaram, de maneira geral, baixa capacidade de indução de celulases e hemicelulases em C. cubensis. Zimograma contendo substrato fluorescente metillumbelliferil β-D-glicopiranosideo, demonstrou que C. cubensis foi capaz de produzir atividade de β-glicosidase quando cultivado em todas as fontes de carbono, exceto em manose e galactose. Extratos produzidos por C. cubensis cultivado em fontes complexas, apresentaram uma β-glicosidase de 55,6 kDa. A presença de possíveis complexos de altos pesos moleculares, contendo atividade de β-glicosidase, também foi detectada. Dentre os extratos produzidos por C. cubensis em presença de fontes simples, o substrato lactose induziu a produção do mesmo grupo de β-glicosidases que as fontes de carbono complexas no fungo. Extratos produzidos pelo fungo cultivado tanto em xilose quanto em arabinose também apresentaram bandas de atividades com elevados pesos moleculares. Extratos produzidos por C. cubensis cultivado em xilose apresentaram ainda uma β-glicosidase de 74 kDa. Já os extratos produzidos por cultivos em arabinose apresentaram, além de complexos com alto peso molecular, duas bandas para atividade de β-glicosidase; uma banda de 48 kDa e outra de 55,6 kDa. Extratos produzidos por C. cubensis crescidos em glicose apresentaram duas bandas de atividades de β-glicosidase, sendo uma banda de 106,8 kDa e outra de 48 kDa. Zimograma contendo xilana birchwood (XB-SDS- PAGE) como substrato, demonstrou que C. cubensis foi capaz de produzir uma xilanase constitutiva de 19 kDa quando crescido em todas as fontes testadas. A metodologia de XB-SDS-PAGE mostrou que C. cubensis foi capaz de produzir uma xilanase constitutiva de 19 kDa, quando crescido em qualquer uma das fontes testadas. Extratos produzidos pelo fungo crescido em farelo de trigo, CMC e xilana Birchwood, apresentaram, no gel de zimograma, uma região bem definida de atividade de xilanase entre 97 e 39 kDa de massa molecular. Locust bean gum e citrus peel foram capazes de induzir a produção de uma xilanase de 37,3 kDa. Xilose induziu a produção de duas xilanases, uma de 53,2 kDa e outra de 47,9 kDa. O extrato produzido pelo fungo crescido em arabinose apresentou um padrão de bandas semelhante ao encontrado no extrato oriundo do crescimento em xilose. Extratos oriundos do crescimento de C. cubensis em glicose, lactose, galactose e manose apresentaram somente a atividade da xilanase expressa constitutivamente de 19 kDa. Zimograma contendo CMC como substrato, demonstrou que apenas em extratos produzidos por C. cubensis crescidos em manose e xilose não foi possível observar atividade de endoglicanase. Farelo de trigo, CMC e xilana Birchwood induziram em C. cubensis a produção de duas endoglicanases, uma de 38 kDa e outra de 55,6 kDa. Quando C. cubensis cresceu em glicose, LBG, CP, lactose, galactose, arabinose e celobiose foi possível visualizar a produção de uma endoglicanase de 38 kDa. Analisando os resultados das atividades enzimáticas juntamente com as análises em zimograma, é patente que fontes complexas como farelo de trigo, CMC e xilana Birchwood, possuem elevado potencial indutor quanto à produção das enzimas envolvidas na sacarificação da biomassa em C. cubensis. Já os extratos produzidos por C. cubensis cultivados em presença de fontes de carbono simples, apesar de não apresentarem, quantitativamente, valores expressivos de atividade de celulases e hemicelulases, apresentaram, de maneira qualitativa, atividades de celulases e hemicelulases quando analisados através de zimogramas. Isto comprova que fontes de carbono simples podem estar envolvidas na ativação da produção tanto de celulases quanto de hemicelulases em C. cubensis.