Mutantes insercionais de Magnaporthe grisea com patogenicidade alterada em arroz - Marchi, Carlos Eduardo (2003)
Em Magnaporthe grisea, agente causal da brusone, mutagênese insercional mediada por transformação tem constituído estratégia para a identificação de genes essenciais para a patogenicidade em arroz. A técnica REMI, integração mediada por enzima de restrição, merece destaque em virtude da eficiência de transformação e da predominância de integrações simples. Visando a implantação de programa de mutagênese insercional em M. grisea, os objetivos deste trabalho incluíram: (1) adequar as condições para a obtenção e regeneração de protoplastos do ascomiceto, (2) estabelecer sistema de transformação REMI em M. grisea, avaliando o potencial dos protoplastos e do vetor pAN7-1 e (3) selecionar e caracterizar mutantes com patogenicidade alterada em plantas de arroz. Produção eficiente de protoplastos foi alcançada com o uso simultâneo de 10 mg de Lysing Enzymes e 10 mg de Cellulase Onozuka R10 em 3 mL de MgSO 4 a 1,2 M / NaH 2 PO 4 a 0,01 M (pH = 5,8). Protoplastos de M. grisea I-22 liberados com 3 horas de hidrólise enzimática apresentaram maior capacidade de regeneração da parede celular. Quando expostos ao vetor pAN7-1, os protoplastos foram prontamente transformados para a resistência à higromicina. Quando pAN7-1- HindIII foi usado para transformar I-22 na presença de HindIII, a freqüência de transformantes foi 1,1 a 8,1 vezes superior ao tratamento sem a adição da endonuclease de restrição. No geral, a melhor concentração de HindIII foi 5 unidades/reação de transformação. A partir de testes de patogenicidade envolvendo 125 transformantes, principalmente gerados por REMI, foi possível selecionar cinco mutantes com alterações consistentes na patogênese. Dois desses mutantes, T108 e T93, causaram poucas lesões em folhas de arroz, enquanto o mutante T251 não foi patogênico. A alteração na patogenicidade de T108 foi acompanhada pela menor capacidade de desenvolvimento in vitro. Quando inoculado em plantas de arroz, o mutante T41 apresentou agressividade reduzida, caracterizada por lesões arredondadas de tamanho limitado. Por sua vez, o período de incubação para o mutante T72 foi mais longo do que o do isolado selvagem. Além disso, atrasos consideráveis na germinação de conídios e na formação de apressórios foram detectados em T72. Os mutantes T93 e T251 apresentaram fenótipos semelhantes quando em cultura, caracterizados pela pigmentação marrom. Análises Southern blots de quatro mutantes indicaram que em 50 % dos casos, T108 e T251, apenas uma cópia de pAN7-1 se integrou em um único sítio no genoma. No mutante T251 ocorreu evento REMI propriamente dito. Os mutantes T41 e T93 apresentaram padrões de integração mais complexos.