Purificação e caracterização parciais de serino e cisteíno proteases de Sitophilus zeamais (Coleoptera: Curculionidae) - Silva, Luciana Barboza (2009)
Serino e cisteíno proteases foram purificadas de uma população susceptível e duas resistentes a inseticidas (uma com custo associado a resistência e outra sem custo) de Sitophilus zeamais. Utilizou-se coluna de afinidade aprotinina-agarose para purificar serino protease das três populações. O maior fator de purificação obtido foi para a população resistente sem custo (51,20x), com um rendimento de 14,8% e atividade específica de 875μM∕min∕mg proteína. Na SDS-PAGE uma banda de 56 kDa ficou visível nas três populações e na população resistente sem custo uma outra banda de 70 kDa também foi observada. A enzima parcialmente purificada das três populações foi inibida por PMSF, TLCK, aprotinina, benzamidina e SBTI, indicando a presença de serina e histidina no centro ativo da enzima o que a caracteriza como tripsina-like. A enzima purificada das populações resistentes tem maior afinidade pelo substrato (menor valor de KM app) e a eficiência catalítica para a população resistente sem custo foi aproximadamente duas vezes maior em relação a população susceptível. Para purificar cisteíno protease das três populações a coluna de afinidade thiol-sepharose foi utilizada. Um material homogêneo foi obtido com a purificação de cisteíno, conforme indicado na SDS-PAGE. Uma única banda, de 74 kDa foi visível na população susceptível, enquanto duas bandas de 72 e 83, e 68 e 74 kDa apareceram na população resistente com e sem custo, respectivamente. A identificação de cisteíno protease foi confirmada pelos ensaios com inibidores, realizados com as frações que apresentaram atividade proteolítica, eluídas da coluna thiol-sepharose. As cisteíno proteases, parcialmente purificadas das três populações apresentaram um comportamento diferente quanto a degradação de caseína e inibidores utilizados. A enzima parcialmente purificada da população resistente com custo foi menos sensível ao inibidor E-64, apresentando maior valor de I50 comparado as outras populações analisadas. A afinidade (i.e. KM app) da enzima pelo substrato foi similar entre as populações, porém a Vmax app foi variável, sendo que a população resistente com custo apresentou valor 5x superior, enquanto a população resistente sem custo foi 3x maior do que a Vmax app da população susceptível. Os resultados desta investigação confirmam que as populações resistentes a piretróides, são mais eficientes quanto a atividade de tripsina-like proteases, as quais tem um papel importante na mitigação do custo fisiológico associado com a manutenção dos mecanismos de resistência a inseticidas em algumas populações de S. zeamais. O papel de cisteíno proteases na mitigação do custo associado a resistência parece ser secundário em relação a serino protease.