Avaliação do potencial nematicida de Pycnoporus sanguineus e de suas proteases - Tavares, Gabriella Peterlini (2016)
Fungos nematófagos e fungos produtores de compostos com atividade nematicida representam uma alternativa potencialmente viável para o controle da população de nematoides parasitas. Além de promover a captura de nematoides por meio de hifas especializadas ou liberação de toxinas imobilizantes, a principal característica que confere potencial nematicida a esses fungos é a produção de enzimas extracelulares, principalmente as proteases, que atuam destruindo a cutícula dos nematoides por meio de hidrólise enzimática. Diante deste contexto o presente trabalho teve como objetivo produzir, purificar parcialmente, caracterizar e avaliar a aplicação de proteases do fungo Pycnoporus sanguineus PYC 02 no controle de Panagrellus redivivus. Micélios fúngicos foram obtidos através da transferência de discos de cultura do isolado previamente mantidos em meio BDA 2% (batata-dextrose-ágar), os quais foram transferidos para frascos contendo meio sólido composto por farelo de trigo acrescido de solução mineral estéril. O extrato bruto foi obtido após seis dias de incubação do fungo em BOD no escuro a 28°C. A purificação do extrato bruto se deu em duas etapas: ultrafiltração e cromatografia de troca iônica. Todas as etapas de purificação foram acompanhadas por eletroforese SDS-PAGE e o perfil de proteases das amostras foi avaliado por meio de um zimograma. As enzimas parcialmente purificadas, assim como o extrato bruto, foram caracterizadas em relação ao pH, à temperatura e à influência de íons e efetores no meio de reação. Por fim, foi avaliada a atividade nematicida dos extratos e das proteases parcialmente purificadas de P. sanguineus sobre larvas de P. redivivus. Após a purificação foram obtidos dois pools com atividade proteolítica denominados pool 1 e pool 2, que obtiveram fator de purificação de 6,14 e 1,67 respectivamente. O pool 1 apresentou atividade máxima em pH 8 e 50 °C. Observou-se um aumento da atividade enzimática em presença de íons Fe 2+ enquanto que a atividade foi inibida em presença de EDTA, SDS e Zn 2+ . Já o pool 2 apresentou atividade máxima em pH 3 e 50 °C, sua atividade foi fortemente inibida por SDS. Quanto ao potencial nematicida foi observado um percentual de redução de xlarvas de P.redivivus após 24 horas equivalente a 81,5% para os micélios do fungo, 24,4% para o extrato bruto, 50,5% para o pool 1 e 41% para o pool 2. Após 48 horas de ensaio essas percentagens foram de 80,9%, 55,8%, e 61,2% e 68,8% respectivamente. Diante dos resultados, foi demostrado que o fungo Pycnoporus sanguineus PYC 02, embora não seja classificado como fungo nematófago foi eficiente no controle de larvas de Panagrellus redivivus. Além das proteases ácidas já descritas na literatura, P. sanguineus quando cultivado em fermentação no estado sólido utilizando farelo de trigo como substrato, também produz ao menos uma protease alcalina. Estudos futuros sobre a produção de enzimas e metabólitos com atividade nematicida de Pycnoporus sanguineus PYC 02 são necessários para elucidar os mecanismos moleculares de atuação deste fungo como um possível agente biocontrolador.