Efeitos de antissoros específicos para proteínas associadas a matriz peritrófica, silenciamento gênico da quitinase 1 e morfologia do intestino médio durante a metamorfose de flebotomíneos - Malta, Juliana (2016)
Flebotomíneos (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) são importantes vetores das leishmanioses, doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania, distribuídos em dois grandes gêneros de importância médica: Phlebotomus no Velho Mundo e Lutzomyia no Novo Mundo. Após a ingestão de sangue o bolo alimentar é envolto por uma matriz quitino-proteica, chamada matriz peritrófica (MP). Em uma infecção por Leishmania, o intestino do vetor tem papel crucial, pois, para se estabelecer, o protozoário deve escapar do espaço endoperitrófico e se fixar na parede do intestino para evitar sua eliminação durante a excreção. Nesse sentido, a MP funciona como barreira ao desenvolvimento do parasito, sendo um componente importante na competência vetorial de flebotomíneos. Neste trabalho foi estudado o efeito da alimentação com células sanguíneas reconstituídas com anti-soros específicos para duas proteínas associadas à MP, a quitinase PpChit1 e a peritrofina PpPer2, na morfologia da MP de fêmeas de Phebotomus papatasi. A MP foi avaliada por microscopia de luz (ML) e microscopia eletrônica de transmissão (MET) (24, 42–46, 48 e 72 h após a alimentação), microscopia de força atômica (MFA) (30 h após a alimentação) e microscopia confocal (WGA-FITC) (72 horas após a alimentação). Nesta mesma espécie, também foi estudado a inibição da expressão de PpChit1 pela técnica de RNA de interferência (RNAi) após a injeção de dsPpChit1 (24, 48, 72 e 96 h após a alimentação sanguínea). Adicionalmente, o desenvolvimento pós embrionário do intestino médio foi investigado nas seguintes fases/estágios: larvas de 4o instar com três dias (L4-3) e com cinco dias (L4-5) após a ecdise, pré-pupa, pupa 24 horas e 72 horas após início da metamorfose e adulto recém-emergido, nos flebotomíneos Lutzomyia longipalpis e P. papatasi. Amostras de intestinos médios dissecados de cada fase foram avaliados por microscopias de luz (ML), eletrônica de transmissão (MET) e fluorescência. Verificamos que a alimentação de fêmeas de P. papatasi com antisoros específicos para PpChit1 e PpPer1, levou a um aumento na espessura da MP 72 h após a alimentação, bem como um aumento na amplitude da rugosidade na superfície da MP 30 h após a alimentação. A detecção de quitina com WGA-FITC, identificou que 72 h após a alimentação com anti-PpChit1, o conteúdo de quitina associada a MP no intestino médio do inseto era maior que nos insetos alimentados com soro naïve. A alimentação com antisoros específicos contra as proteínas associadas a MP (PpChit1 e PpPer2) afetam a cinética de maturação e degradação da MP, evidenciando o papel dessas proteínas na estruturação da MP de P. papatasi. A injeção de dsPpChit1 levou a uma reducão nos níveis de transcritos em todos os horários analisados, sendo esses resultados o primeiro passo para contribuir futuramente para o entendimento do papel de PpChit1 na MP P. papatasi. As mudanças morfológicas no intestino médio das duas espécies tiveram início no quarto instar larval, no entanto, em P. papatasi o processo degenerativo das células epiteliais iniciou um pouco antes em L4-3 enquanto que em L. longipalpis em L4-5. Durante a metamorfose, células regerativas foram vistas na base do epitélio, nas duas espécies. Além disso, as marcações positivas para a histona fosforilada H3, em ambas, sugerem que as células regenerativas se dividem durante o processo de remodelamento do intestino médio em flebotomíneos. A histólise do epitélio intestinal larval se dá possivelmente por autofagia, pela presença de numerosos vacúolos autofágicos, bem como por marcações positivas para a proteína LC3, entretanto, a detecção de caspase-3 sugere que a apoptose possa acontecer durante o processo de troca do epitélio larval pelo do adulto. Finalmente, o estudo do remodelamento do intestino médio em P. papatasi e L. longipalpis mostrou de forma inédita que o processo é conservado nas duas espécies, se diferenciando apenas no tempo do início do processo degenerativo entre as duas espécies. Os conhecimentos relacionados as proteínas da MP, bem como ao desenvolvimento pós-embrionário do intestino médio em flebotomíneos, o qual tem papel fundamental na transmissão de Leishmania, são importantes para uma melhor compreensão do inseto vetor.