Obtenção de linhagens recombinantes de Penicillium griseoroseum para produção de poligalacturonase - Ribeiro, João Batista (2005)
Análise de um fragmento de DNA de 170 pb da região promotora do gene pgg2 contendo um possível CCAAT-box localizado a -270 pares de bases (pb) do códon de início da tradução, por meio de ensaios de migração retardada em gel, revelou a formação de complexos específicos deste fragmento de DNA com proteínas nucleares obtidas a partir de micélio cultivado em meio contendo pectina. A ligação de proteínas no elemento CCAAT foi confirmada quando a análise foi realizada utilizando um oligonucleotídeo fita dupla contendo essa seqüência. Substituição da seqüência original pela seqüência GTAGG diminuiu a formação de complexos específicos, comprovando o envolvimento do elemento CCAAT na regulação da expressão do gene pgg2. Um oligonucleotídeo de 23 pb contendo a seqüência CTACAGTG, similar à seqüência de um cis-elemento de resposta a AMPc encontrado em promotores de leveduras e mamíferos, também foi usado como sonda em ensaios de migração retardada em gel. Complexos de DNA-proteínas não foram detectados quando se utilizou extratos protéicos nucleares, preparados a partir de micélio cultivado em glicose e extrato de levedura, sugerindo que o elemento CTACAGTG não representa um sítio para a ligação de proteínas ativadoras. Foi construído um vetor para inativação do gene pgg2 de P. griseoroseum, denominado pPG15pgg2Δniafo, o qual contém o gene pgg2 interrompido por um fragmento de DNA de 4,0 Kb, correspondente ao gene nia de Fusarium oxysporum. A inativação do gene pgg2, demonstrou que a poligalacturonase codificada por este gene é responsável por 90 % da atividade total de PG de P. griseoroseum. Foi construído um vetor para expressão do gene pgg2 sob o controle do promotor constitutivo do gene gpdA de Aspergillus nidulans, o qual foi utilizado na transformação da linhagem PG63 de P. griseoroseum. Foram obtidas linhagens transformantes que, quando cultivadas na presença de glicose, sacarose ou caldo de cana, apresentaram aumento na atividade de PG de até 12 vezes em relação à linhagem PG63 cultivada em pectina e extrato de levedura. A linhagem recombinante 146 apresentou aumento na atividade de PG quando cultivada em meio contendo glicose (1%) por 48 a 96 horas, utilizando-se 106 ou 107 conídios/mL do meio de cultura. Embora tenha sido observado menor massa micelial seca, quando as linhagens recombinantes foram cultivadas em sacarose e caldo de cana, a atividade de PG foi de 90 % da determinada quando estas linhagens foram cultivadas em glicose. A poligalacturonase produzida pela linhagem recombinante 146 de P. griseoroseum apresentou alta atividade na faixa de pH de 3,5 a 5,0 e nas temperaturas de 30 a 60oC, sendo estável quando armazenada por pelo menos 5 semanas nas temperaturas de -20, 4 e 30oC. No entanto, apresentou baixa termoestabilidade, sofrendo desnaturação quando pré- incubada por 1 hora nas temperaturas de 40, 50 e 60oC. Os níveis enzimáticos relatados neste trabalho e as propriedades físico-químicas da PG II produzida pela linhagem recombinante 146 de P. griseoroseum demonstram a eficiência do sistema de expressão desenvolvido e que a PG II é uma enzima adequada para aplicação na indústria de processamento de sucos de frutas.