Obtenção de primers microssatélite e desenvolvimento, validação e mapeamento de marcadores SCAR em feijoeiro-comum - Queiroz, Vagner Tebaldi de (2004)
Embora apresente várias limitações, a técnica de RAPD ainda representa a principal ferramenta utilizada no Programa de Melhoramento Genético do Feijoeiro- comum BIOAGRO/UFV. Para contornar os problemas apresentados por esta técnica, a estratégia utilizada por vários pesquisadores tem sido a conversão dos marcadores RAPD em marcadores SCAR e o desenvolvimento de primers microssatélite. Assim, no presente trabalho foram desenvolvidos 5 primers SCAR para mancha-angular, 5 primers para ferrugem e 7 primers para antracnose. Os primers desenvolvidos para mancha-angular derivaram-se dos marcadores OPM02 425 , OPBA16 669 , OPH13 490 e OPH14+AA19 400 e foram mapeados, em acoplamento, a 5,3, 7,1, 5,6 e 10,1 cM, dos respectivos genes de resistência. Os primers desenvolvidos para ferrugem originaram-se dos marcadores OPAE19 890 , OPX11 550 , OPAJ18+AH10 700 , mas apenas o primer sAE19 foi validado. Este foi mapeado, em repulsão, a 1,0 cM do gene de resistência Ur-11. Os primers para antracnose foram desenvolvidos, a partir da seqüência dos fragmentos OPAZ20 940 , OPY20 830 , OPC08 900 , OPZ04 560 , OPB03 1800 , OPZ09 950 , OPH18 830 . Destes, apenas os primers sAZ20, sY20, sC08, sZ04 foram mapeados, em acoplamento, a 7,1, 1,2, 7,8 e 2,9 cM, dos respectivos genes de resistência. Os primers microssatélite foram desenvolvidos, a partir das seqüências de fragmentos de DNA genômico de 3 pequenas bibliotecas enriquecidas. As bibliotecas enriquecidas para as repetições GGC, CCA e AT permitiram a seleção de 79, 172 e 50 clones positivos, respectivamente. Do total de 301 clones que foram identificados, 153 já foram seqüenciados. Observou-se que 40 (26%) clones seqüenciados apresentaram fragmentos de DNA contendo microssatélite, os quais variaram quanto ao tipo, número e tamanho. As seqüências apresentaram repetições de di-, tri-, tetra- e até pentanucleotídeos. Em um mesmo fragmento, foram encontrados até 3 microssatélites. Entre as seqüências analisadas, foram observadas repetições perfeitas, imperfeitas e compostas, variarando entre 12 e 24 pb. Até o momento, foram desenhados e testados 10 pares de primers, sendo um deles originado da seqüência do marcador RAPD OPAZ20 940 . Destes, apenas 5 pares (FCctc001, FCggc001, FCccg001, FCccg002 e FCgca001) amplificaram fragmentos com tamanho esperado e bem definidos. Entretanto, esses primers foram monofórficos, quando testados entre diferentes cultivares andinos e mesoamericanos. Os primers SCAR, desenvolvidos e validados no presente trabalho, foram testados juntamente com 45 pares de primers microssatélite comerciais, entre os genitores de uma população de 154 RIL ́s. Dos primers selecionados, 7 foram mapeados em 10 grupos de um mapa parcial de ligação já existente e 1 permaneceu não-ligado. O mapa de ligação sofreu pequena variação no tamanho (247,8/252 cM) e no número de grupos de ligação (9/10 grupos). Entretanto, pela análise de variância foram constatadas associações significativas desses marcadores com diferentes características quantitativas. As associações mais significativas foram constatadas por meio de análises de regressão stepwise, as quais promoveram alteração no valor de R 2 da regressão múltipla para algumas das características. As características MAT (número de dias até a maturação), VAPLA (número médio de vagens por planta), SEPLA (número médio de sementes por planta) e PRVAG (produção média por vagem), que apresentavam valores de R 2 de 40,14; 28,99; 14,03 e 17,13 , tiveram um aumento para 44,30; 34,53; 21,92 e 26,03, respectivamente. A inclusão do marcador sH13 no GL 07 possibilitou a identificação de um novo QTL para a característica VAPLA. Este marcador também mostrou-se associado ao QTL, anteriormente, descrito para SEPLA. O marcador BM165 foi mapeado no GL 02 e mostrou-se associado a 4 QTLs diferentes, identificados para as características MAT, P100 (peso de 100 sementes), SEPLA e PRVAG.