Utilização de bacteriófagos no biocontrole de Salmonella sp - Albino, Luiz Augusto Aguiar (2016)
A elevação da produção e comercialização de alimentos é acompanhada pelo aumento das infecções, hospitalizações e mortes relacionadas ao consumo de alimentos contaminados. Entre os alimentos relacionados a infecções alimentares, podemos destacar a carne suína e os ovos, como os principais responsáveis pelos casos de infecções alimentares, e o principal patógeno envolvido no consumo destes alimentos no mundo, são Salmonella Enteritidis em ovos e Salmonella Typhimurium em carne suína. O uso indiscriminado de antimicrobianos na produção animal promoveu diversos mecanismos de resistência em Salmonella, dificultando o controle e a eliminação deste patógeno. Desta forma, ha uma necessidade de desenvolvimento de novas práticas terapêuticas e os bacteriófagos ressurgem como uma alternativa de controle. O objetivo deste trabalho foi isolar e avaliar a atividade de bacteriófagos contra Salmonella Typhimurium e/ou Salmonella Enteritidis em poedeiras, ovos, suínos e na carne suína. No primeiro capítulo é apresentado a utilização de bacteriófagos em poedeiras e nas superfícies de ovos para a avaliação de seu efeito como método de controle de Salmonella Enteritidis. Foram realizados 2 experimentos distintos. O primeiro experimento avaliou o efeito de bacteriófagos livres e microencapsulados em ovos (clara, gema e casca) de galinhas poedeiras contaminadas com Salmonella Enteritidis. Foram utilizadas 50 poedeiras, distribuídas em 5 tratamentos, sendo T1 - Controle positivo - Aves contaminadas com Salmonella Enteritidis (ACSE); T2 - ACSE e inoculadas com bacteriófagos livres (BL); T3 - ACSE e inoculadas com bacteriófagos microencapsulados (BM); T4 - Não CSE e inoculadas com BL; T5 - Não CSE e inoculadas com BM. As aves do T1, T2 e T3 foram contaminadas oralmente pela ingestão de 1 mL de Salmonella Enteritidis (~1O6UFC-mL-1) enquanto os tratamentos T4 e T5 receberam apenas 1 mL de solução tampão PBS esterilizado. Seis horas apos a inoculação do patógeno, e em todo período experimental, as aves do T2 e T4 receberam 1 mL da suspensão de bacteriófagos (~1O9 UFP-mL-1), enquanto as aves dos tratamentos T3 e T5 receberam 1 mL da suspensão de bacteriófagos micro encapsulados (~1O9 UFP-mL-1). A aves tratadas com bacteriófagos livres apresentaram menor detecção do patógeno na superfície da casca, sugerindo que possa ter ocorrido redução da contaminação pelo patógeno. Foi possível isolar bacteriófagos na casca de todas os tratamentos em que ele foi utilizado. Além disso, também foi possível seu isolamento na clara dos ovos do T2. A utilização de bacteriófagos não eliminou o patógeno, mas reduziu o número de amostras positivas ao longo do tempo. O experimento dois avaliou diferentes metodologias de higienização de ovos em relação a presença de Salmonella Enteritidis em diferentes temperaturas e intervalos de tempo. Os ovos (n =720) foram separados em 8 grupos contendo trés diferentes combinações de tratamentos, com 90 ovos cada, sendo os tratamentos: higienizado (H), não higienizado (H), pasteurizado (P), não pasteurizado (P), com bacteriófagos (B), e sem bacteriófagos B), sendo representados por T1 (HPB), T2 (HPB), T3 (HPB), T4 (HP B), T5 (HPB), T6 (HPB), T7 (HPB), T8 (HPB). Os tratamentos foram incubados a 4 0C, 7 0C e 24 0C e analisados nos intervalos de 1, 3, 7, 14 e 28 dias. A presença do patógeno foi observada em todas as amostras de casca incubada em todas as temperaturas e intervalos de tempos. Entretanto sua detecção na clara e na gema não foi possível quando os ovos foram incubados a 4 0C. Os tratamentos higienizados (T5 (HPB), T6 (HPB), T7 (HPB) e T8 (HPB)) apresentaram os maiores valores (p < 0,05) em relação aos outros tratamentos ao longo do tempo nas diferentes temperaturas. Além disso, o tratamento T2 (HPB) obteve, os menores valores médios de crescimentos (log UFC-mL-1) do patógeno em todas as temperaturas e amostras analisadas (p < 0,05). Estes resultados sugerem que a higienização e a pasteurização dos ovos podem contribuir para a contaminação e penetração do patógeno ao longo do tempo, mesmo em baixas temperaturas. Além disso, a utilização de bacteriófagos resultou em uma contagem media (log UFC-mL-1) do patógeno inferior na maioria dos tratamentos em que foi utilizado. O capitulo dois apresenta o isolamento de bacteriófagos específicos para as duas principais estirpes de Salmonela e sua utilização no controle do patógeno em ovos líquidos e em carne suína moída. Os ovos líquidos e a carne moída suína foram contaminados com os patógenos, incubados a 4 0C e a 24 0C e as amostras analisadas quanto a redução do patógeno em diferentes intervalos de tempos (1 dia, 7 dias e 14 dias. A Multiplicidade de Infecções(MOI) utilizada em todos os tratamentos foi de 1x 101 UFP/UFC. Foi possível observar redução significativa (p < 0,05) da concentração dos patógenos em todos os tratamentos realizados a 24 0C. A 4 0C o bacteriófago foi capaz de reduzir (p < 0,05) a concentração de Salmonella Typhimurium em um dia e uma semana de incubação na carne suína moída e no ovo líquidos. Entretanto, só foi possível observar a redução (p < 0,05) de Salmonella Enteritidis nas amostras de carne suína moída incubadas por 1 dia e 1 semana a 40C. Após duas semanas de incubação a 40C não houve redução significativa (p >0,05) dos patógenos em nenhum dos alimentos avaliados. Os maiores índices de redução ocorreram a 40C quando Salmonella Typhimurium foi o hospedeiro, sendo de 1,65 log10 UFC-g-1 em carne suína moída e 3,14 l log10 UFC- g-1 em ovos líquidos. Concluiu-se que o bacteriófago foi capaz de reduzir a contaminação de Salmonella Typhimurium em ambos alimentos, entretanto seu efeito foi não significativo para o controle de Salmonella Enteritidis em ovos líquidos. O terceiro capitulo teve como objetivo avaliar o efeito causado pelos bacteriófagos no trato gastrointestinal de suínos em relação ao efeito causado pelos antibióticos utilizados como melhoradores de desempenho. Dezoito suínos utilizados para o experimento foram divididos em três tratamentos: Tratamento controle (TC), tratamento com antibióticos (TA) e tratamento com bacteriófagos (TB). A ração dos suínos do TA foi suplementada com AUREO S-P 250®. Os animais do TB receberam diariamente, via oral, 5 mL do coquetel contendo 1,0 x 1010 UFP-mL-1 de bacteriófagos e os suínos do TC receberam apenas a ração basal. Após os 21 dias de tratamento os animais foram novamente pesados e abatidos, e o conteúdo fecal do ileo, ceco e colón foram coletados para a realização das análises. Para avaliar a diversidade de bactérias no colón, ileo e ceco, a região V3 do gene 16S rRNA do DNA metagenômico foi amplificada pela reação da polimerase em cadeia (PCR), usando os primers 338F e 518R e analisada pela DGGE. Analisando o dendograma foi possível observar que a maioria das amostras do ceco e do colón se agruparam de forma heterogênea. Estes agrupamentos apresentaram diferença significativa (p < 0,01) na composição microbiana presentes em cada amostra. Mesmo os efeitos dos tratamentos não terem se agrupado de forma homogênea no dendograma, os padrões de amplicons das amostras mostrou efeito significativo (p < 0,10) somente na comparação entre o TA e o TC, enquanto para as outras comparações (TB x TC e TB x TA) os efeitos não foram significativos (p > 0,05). Este resultado sugere uma pequena mudança na composição da microbiota dos animais do TB, apesar do resultado não ter sido estatisticamente significativo.