β-Glicosidases do fungo fitopatógeno Chrysoporthe cubensis: purificação, caracterização e aplicação na sacarificação do bagaço de cana-de- açúcar - Andrade, Lorena Gusmão Alvarenga de (2014)
Neste trabalho, um complexo de β-glicosidases do fungo fitopatógeno Chrysoporthe cubensis LPF-1 foi purificado, caracterizado bioquímica e cineticamente e avaliado quanto ao seu potencial em aplicação no processo de sacarificação de bagaço de cana de açúcar. O fungo C. cubensis foi cultivado sob fermentação no estado sólido (SSF) contendo farelo de trigo como fonte de carbono e, após 5 dias de fermentação o extrato enzimático foi obtido. O conjunto de três β-glicosidases, foi purificado por cromatografias de troca iônica e filtração em gel e, ao final do processo, apresentou um fator de purificação de 2,05 vezes com um rendimento de 64,5 %. As massas moleculares das β-glicosidases foram de 85,43 e 74,17 kDa, para E2 e E3, respectivamente, e de 63,09, 60,25 e 56,23 kDa para E1a, E1b e E1c, respectivamente, quando estimadas por SDS-PAGE. O complexo de β-glicosidases (Ec) exibiu atividade máxima em pH 4,0 e na temperatura de 60°C. Ec foi estável na faixa de pH de 2,0-8,0 e apresentou alta termoestabilidade nas temperaturas de 50, 60 e 70 °C. Os valores de meia-vida para Ec foram de 52 horas e 39 minutos, 35 horas e 30 minutos e, 15,3 minutos, a 50, 60 e 70 °C, respectivamente. A atividade de β-glicosidase de Ec foi completamente inibida por HgCl2 e MnSO4, na concentração de 10 mM e, o complexo de β-glicosidases apresentou especificidade absoluta para resíduos de glicose com ligações do tipo β. Os valores de KM para Ec de 0,132 mM e 0,7816 mM e Vmáx de 0,416 μM.min-1 e Vmáx 0,3414 μM.min-1, foram obtidos utilizando os substratos ρNPβGlc e celobiose, respectivamente. Ec apresentou inibição do tipo competitiva para a glicose com valor de Ki 8,43 mM. As β-glicosidases foram utilizadas em experimentos de sacarificação do bagaço de cana, submetido previamente ao pré- tratamento alcalino. Ec foi utilizado para suplementação tanto do extrato proveniente do C. cubensis como também para um coquetel comercial de celulases. Os resultados da sacarificação com as preparações suplementadas com as β-glicosidases foram comparados com aqueles obtidos utilizando somente o coquetel comercial e o extrato do C. cubensis e, a produção de glicose e xilose foi avaliada durante 72 horas de hidrólise. A sacarificação realizada com o coquetel comercial suplementado com as β-glicosidases promoveu a liberação de 2,82 g/L de glicose e 0,98 g/L de xilose ao passo que, somente com o coquetel comercial foram liberados 1,78 g/L de glicose e 0,85 g/L de xilose. Por outro lado, a sacarificação com o extrato do C. cubensis liberou 1,69 g/L de glicose e 1,64 g/L de xilose enquanto, que o mesmo extrato suplementado com as β-glicosidases, promoveu a liberação de 2,62 g/L de glicose e 2,65 g/L de xilose. Dessa forma, estes resultados demonstram que as β-glicosidases do C. cubensis apresentam potencial para serem utilizadas como fonte de suplementação em outras preparações enzimáticas, visto que a eficiência de hidrólise observada foi superior à observada com o coquetel comercial de celulases bem como com o extrato de C. cubensis.