Obtenção de hibridomas para a produção de anticorpos monoclonais contra a proteína E-NTPDase-2 de Leishmania major - Freitas, Rodrigo de Barros (2010)
As Leishmanioses são doenças parasitárias causadas por protozoários da ordem Kinetoplastida, família Trypanossomatidae e gênero Leishmania que atualmente representam um problema de saúde pública no Brasil e em outros países do mundo. As E-NTPDases ou apirases, presentes nesses parasitos, têm como principal função a degradação de nucleotídeos, especialmente extracelulares di e/ou trifosfatados, permitindo ao parasito a modulação da resposta imune do hospedeiro, que necessecita da sinalização purinérgica, e favorecendo o desenvolvimento celular por sua participação na via de recuperação de purinas das quais os parasitos são dependentes. Os anticorpos monoclonais são oriundos de um hibridoma para reconhecimento de um determinado antígeno e podem ser selecionados para uma especificidade desejada, produzidos em grande quantidade e com boa qualidade. Este trabalho teve como objetivo a expressão heteróloga da proteína E-NTPDase-2 de L.major e produção de hibridomas secretores de anticorpos monoclonais contra esta proteína. Para isso foi feito o desenho de iniciadores específicos visando a amplificação da região codificante da porção solúvel (ecto-domínio) da E-NTPDase-2, sem a porção codificante para a região do peptídeo aminoterminal, perfazendo um DNA com 1053 pares de base. O amplicom foi obtido com amplificação por PCR, clonado em vetor de amplificação (pJET-bunt) e de expressão (pET-21b) em sistema bacteriano (E.coli DH5α). A expressão da proteína E-NTPDase-2 foi realizada em sistema bacteriano (E.coli BL-21) e a purificação foi feita por cromatografia de afinidade em coluna de Ni2+-agarose (Ni-NTA). Com a proteína purificada procedeu-se as imunizações dos camundongos e consequente confirmação da produção de anticorpos anti- NTPDase 2 por DOT ELISA. A fusão da células B dos camundongos imunizados, com as células de mieloma (Sp20) foi realizada para obteção dos hibridomas. Desta maneira foram isolados hibridomas anti-E-NTPDase-2 de L.major que poderão ser utilizados em várias aplicações futuras, como o diagnóstico e tratamento da Leishmaniose canina.