Transformação genética de nós cotiledonares de soja visando à co-supressão do gene da lisofosfatidilcolina aciltransferase - Martins, Polyana Kelly (2007)
A soja (Glycine max L. Merrill) é uma das mais importantes culturas do mundo e a maior do Brasil em área plantada. O Brasil é o segundo maior produtor mundial desta leguminosa atingindo 56,3 milhões de toneladas na safra 2006/2007. (www.conab.gov.br). Assim, modificações usando técnicas de engenharia genética podem facilitar o rápido desenvolvimento de novas variedades com características de interesse agronômico e industrial. Alterações nas proporções relativas dos ácidos graxos na fração óleo podem ser alcançadas por meio do silenciamento gênico de enzimas do tipo aciltransferases, fosfotransferases e dessaturases, envolvidas na biossíntese de ácidos graxos. Os objetivos deste trabalho foram: isolar um fragmento do gene da lisofosfatidilcolina aciltransferase (LPCAT) de soja, construir um cassete de expressão, contendo este fragmento, sob o controle da região promotora do gene da subunidade α da β-conglicinina (promotor semente-específico) e transformar nós cotiledonares de soja com esta construção, visando à co-supressão do gene LPCAT. A análise por RT-PCR mostrou que o gene LPCAT é expresso em todos os estádios de desenvolvimento da semente. O cassete de aproximadamente 800 pb contendo a seqüência do promotor semente-específico e de parte do gene LPCAT foi clonado no vetor binário pCAMBIA 1304, cujo T-DNA apresenta genes para resistência aos antibióticos canamicina, para seleção em bactérias, e Higromicina B para seleção em plantas. A clonagem foi confirmada por meio de PCR, restrição enzimática e seqüenciamento. A construção clonada no vetor pCAMBIA 1304 foi utilizada para a transformação de soja via Agrobacterium tumefaciens e sonicação. Sementes maduras de soja foram desinfetadas e germinadas em meio B5 durante, aproximadamente, 5 dias. A partir de uma semente, dois explantes foram obtidos, primeiramente removendo-se a raiz, em seguida, a maior parte do hipocótilo e finalmente um corte vertical feito para separar os dois cotilédones. Estes explantes foram transformados com suspensão bacteriana mediante sonicação e adição de acetoseringona. Após 3 dias de co-cultivo, os nós-cotiledonares foram transferidos para meio de indução (SIM) sem agente seletivo, durante 14 dias. Em seguida, foi adicionado ao meio SIM 5mg/L de Higromicina B para seleção dos transformantes. Os explantes que sobreviveram a essa seleção foram transferidos para o meio de elongação (SEM), ainda com Higromicina B, e depois para o meio de enraizamento (RM) sem o agente seletivo. Dois meses após inoculação com A. tumefaciens, múltiplos brotos foram produzidos nas regiões nodais resistentes a Higromicina B que estavam em contato direto com o meio. Análises a partir do DNA de folhas de plantas em fase de aclimatação permitiram a detecção de vários eventos de transformação. Dezessete eventos foram confirmados por reações de PCR com primers específicos para seqüências presentes apenas em plantas transformadas.