Expressão transiente de genes de Phakopsora pachyrhizi em genótipos resistentes de soja visando a identificação de genes de avirulência - Abe, Valeria Yukari (2012)
O Brasil é o segundo maior produtor mundial de soja. Atualmente, o principal fator limitante na produção desta cultura é a ferrugem asiática da soja (FAS), cujo agente etiológico é o fungo Phakopsora pachyrhizi. Os fungos causadores das ferrugens são parasitas obrigatórios que durante sua interação com a planta secretam proteínas efetoras que manipulam o metabolismo do hospedeiro e interferem com suas respostas de defesa. Algumas dessas proteínas efetoras, denominadas proteínas Avr, são reconhecidas pelas proteínas codificadas por genes de resistência R, o que desencadeia a resposta de hipersensibilidade (HR) e fenótipo de resistência. Já foram descritos pelo menos cinco genes R (Rpp1 a Rpp5) que conferem resistência a FAS e vários genes que codificam proteínas secretadas por esse fungo foram recentemente identificados. Todavia, ainda não foram identificadas as proteínas efetoras (Avr) reconhecidas pelas proteínas codificadas pelos genes Rpp. Como não existe ainda um sistema de transformação para P. pachyrhizi, uma estratégia para identificar as proteínas Avr desse fungo é a expressão transiente das proteínas efetoras candidatas no citoplasma de variedades resistentes e a observação do possível desencadeamento de resposta de HR. Desta forma, os objetivos específicos deste trabalho foram tentar estabelecer uma metodologia de expressão transiente em soja via agroinfiltração utilizando como gene repórter o gene GUSPlus; estabelecer um protocolo de translocação de proteínas efetoras via sistema de secreção tipo III (SST3) de Pseudomonas syringae pv. glycinea raça 4 (Psg4), e também avaliar a atividade efetora de genes candidatos em genótipos de soja resistentes ao isolado monopustular PPUFV02 de P. pachyrhizi. Não se observou a expressão do gene GUSPlus em folhas de soja agroinfiltradas com Agrobacterium tumefaciens estirpe EHA105, enquanto que utilizando do mesmo preparo de inóculo e concentração de células bacterianas, observou-se a expressão consistente do gene GUSPlus em tabaco. Este resultado invibializou o uso de agroinfiltração no estudo funcional de genes efetores candidatos na soja. Todos os genótipos de soja avaliados foram suscetíveis a Psg4, demonstrando a vialibilidade do uso desta bactéria na análise funcional de proteínas candidatas a efetores mediada por SST3. Melhor reprodutibilidade de sintomas foi observada com a inoculação por infiltração a vácuo de Psg4 numa concentração bacteriana de OD600=0,01, por permitir uma análise dos sintomas de forma gradual. O produto do gene avrB é reconhecido pela produto do gene RPG1, presente em alguns genótipos de soja. A construção pVSP61-avrB, foi capaz de induzir HR no genótipo Williams 82, que contêm o gene RPG1 correspondente, e nos genótipos Conquista e PI 459025. Este resultado permitiu o uso desta construção como controle positivo para a análise funcional de proteínas efetoras putativas de P. pachyrhizi. Assim, 12 sequências foram clonadas no vetor pEDV6. Este vetor permite a expressão de proteínas de interesse fusionadas a sequências-sinais de secreção via SST3, visando a sua posterior translocação para o citosol. Nove das construções com pEDV6-PHPA_RSP transformadas em Psg4 foram submetidas à análise funcional. As plantas inoculadas variaram quanto à severidade dos sintomas observados e não foi constatado fenótipo de HR. Ao invés disso, nos tratamentos foi observado redução, aumento ou ausência de alteração significativa na evolução dos sintomas, de maneira genótipo-dependente. Esses estudos permitiram uma primeira triagem de candidatos a efetores de P. pachyrhizi, selecionando os candidatos PHPA_RSP_71 e PHPA_RSP_78 como os mais promissores para estudos futuros mais detalhados.