Caracterização de linhagens recombinantes de Penicillium griseoroseum: análise do cariótipo, da expressão dos genes plg 1 e pgg 2 e da produção de pectina liase e poligalacturonase em resposta ao pH do meio - Teixeira, Janaina Aparecida (2011)
Os estudos genéticos e fisiológicos realizados com o isolado Penicillium griseoroseum CCT6421 ressaltam as vantagens para a sua aplicação como hospedeiro para produção de proteínas. A obtenção e análise de linhagens recombinantes de P. griseoroseum com alta produção de pectina liase (PL) e poligalacturonase (PG) evidenciaram o eficiente sistema de secreção desse fungo, indicando a possibilidade de utilização deste como plataforma para produção de proteínas de interesse industrial. Entretanto, pouco é conhecido sobre a organização do genoma de P. griseoroseum e das linhagens recombinantes. Neste trabalho foi estimado o tamanho do genoma de P. griseoroseum entre 29,8 e 31,0 Mb, distribuídos em quatro cromossomos. O gene plg1, que codifica PL, está em cópia única no genoma de P. griseoroseum e foi localizado no cromossomo II (9,22 Mb). A linhagem recombinante T105, que possui cópias adicionais do gene plg1 sob controle do promotor de gpd de Aspergillus nidulans, apresentou integrações nos cromossomos II, III e IV. As linhagens recombinantes T146 e T20 possuem, respectivamente, cópias adicionais do gene pgg2 e dos genes pgg2 e plg1, sob o controle do promotor de gpd de A. nidulans. O gene pgg2 codifica PG em P. griseoroseum. A análise da expressão dos genes plg1 e pgg2, nas linhagens recombinantes de P. griseoroseum multi-cópias, mostrou que o aumento do número de cópias dos genes proporciona o aumento da produção enzimática. Uma cópia do gene plg1, sob o controle do promotor constitutivo, proporcionou um aumento de 200 vezes na expressão em relação ao gene endógeno e duas cópias do gene pgg2, também sob o controle do promotor constitutivo, proporcionaram um aumento de 1100 vezes na expressão em relação ao gene endógeno. A produção e secreção de PL e PG pelas linhagens recombinantes T105, T146 e T20 de P. griseoroseum são afetadas pelas condições de cultivo. As linhagens foram cultivadas em meio tamponado MMT (pH 6,8) e em meio não-tamponado MMNT (pH 6,3 3,0), para verificar a expressão dos genes plg1 e pgg2, produção e secreção de PL e PG em diferentes tempos de cultivo. A transcrição dos genes plg1 e pgg2, nas linhagens recombinantes, é constitutiva e não foi detectado variação em ambos os meios. No entanto, a quantidade de proteína total secretada variou em média 7,8 ± 1,1 μg/mL no meio MMT e 3,25 ± 1,50 μg/mL no meio MMNT. A análise por SDS-PAGE das proteínas do sobrenadante da cultura das linhagens possibilitou verificar uma maior quantidade de PL e PG secretada no meio MMT do que no meio MMNT. A secreção de PL e de PG foram afetadas pela variação do pH do meio, apresentando reduções nas atividades de 6,4 e 3,6 vezes, respectivamente, para a atividade detectada em meio MMNT em comparação ao meio MMT. A variação do pH do meio também alterou a morfologia da hifa e do micélio da linhagem recombinante T20, o que pode estar relacionado com a redução da secreção de PL e PG. Os resultados mostram que a maquinaria de transcrição, tradução e secreção de proteínas do fungo P. griseoroseum responde ao aumento do número de cópias de genes no genoma, observando-se as condições de cultivo.