Desenvolvimento de uma estratégia de purificação de avidina e lisozima da clara de ovo - Cassimiro, Débora Mara de Jesus (2018)
As diversas propriedades tecnológicas da avidina e da lisozima propiciam o desenvolvimento de técnicas visando a purificação dessas proteínas a partir da clara de ovo. É desejável que os processos para purificação das proteínas apresentem número de etapas reduzidas, que sejam de baixo custo, além de apresentarem eficiência na separação e elevada pureza das proteínas purificadas. A utilização da cromatografia de troca iônica para a purificação da lisozima apresenta o inconveniente da presença da avidina nas frações de lisozima, devido à similaridade entre o ponto isoelétrico (pI) das proteínas. Para purificação da avidina a cromatografia por afinidade se torna inviável devido ao alto custo do ligante, bem como a baixa vida útil da matriz cromatográfica. Neste estudo, foi utilizado um criogel supermacroporoso ativado com tris hidroximetil aminometano (TRIS) para captura da lisozima da clara de ovo. Em uma segunda etapa, a cromatografia de troca catiônica, através de um criogel ativado com AMPSA (ácido 2- acrilamido2-metil-1-propanosulfônico), foi utilizada para captura da avidina da clara de ovo. Os criogéis utilizados apresentaram estrutura esbranquiçada e esponjosa. A matriz utilizada para captura da lisozima apresentou porosidade igual a 0,79 e a utilizada para captura da avidina 0,90, ambas apresentaram baixa resistência ao escoamento bem como baixa dispersão axial. A capacidade de inchamento, o grau de expansão para o criogel ativado com TRIS e AMPSA foram, respectivamente 15,15 Kg/Kg e 18,34 L/Kg; 19,56 Kg/Kg e 21,05 L/Kg. O coeficiente de dispersão axial variou de 0,0954 a 0,739 cm 2 /min para o criogel de afinidade e de 0,0954 a 5958 cm 2 /min para o criogel de troca catiônica. A altura equivalente (HETP) a pratos teóricos situou-se entre 0,100 e 0,148 cm para o criogel de afinidade e 0,122 a 0,168 cm para o criogel de troca catiônica. A matriz de afinidade apresentou permeabilidade ao escoamento de 3,34 x 10 -13 m 2 e a de troca catiônica de 2,0 x 10 -13 m 2 . Para o criogel de troca catiônica calculou-se também o grau da enxertia (34,15%), a densidade de ligação (1,65 x 10 -3 mol/Kg), o rendimento da enxertia (4%) e a capacidade iônica de ligação (582,74 x 10 -3 mol Na+ /Kg criogel seco ). Na etapa de captura da lisozima, a proteína purificada apresentou pureza média de 90%, fator de purificação igual a 19,42 e rendimento de 30,07%. O efeito da variação do pH sobre o rendimento e a concentração na captura da avidina foi avaliado, sendo que em pH 9,0 maior rendimento médio foi obtido (46,8%) e em pH 10,0 maior concentração média (0,0043 mg/mL) foi recuperada. A lisozima foi purificada satisfatoriamente através da utilização do criogel funcionalizado com o TRIS, evidenciando que o ligante é realmente específico para essa proteína. O novo protocolo para purificação da avidina permitiu que fossem alcançados rendimento e pureza superiores à maioria dos trabalhos relatados na literatura para a mesma proteína, além disso, o protocolo utilizado nesse trabalho utilizou um número de etapas reduzido, bem como reagentes baratos (que conferiram funcionalização à matriz), viabilizando a utilização do mesmo para purificação da proteína e caracterizando-o como uma técnica rápida e de baixo custo.