Caracterização molecular de dois fatores de transcrição WRKY expressos na interação tomateiro - Alternaria solani - Rocha, Cynthia de Melo (2005)
Os genes WRKY codificam proteínas de ligação ao DNA que reconhecem a seqüência conservada de nucleotídeos (T)(T)TGAC(C/T) (W box), presente em promotores de genes de defesa relatados em plantas. As proteínas WRKY podem ser divididas em grupos e subgrupos distintos, com base nas características do domínio WRKY de ligação ao DNA altamente conservado entre os membros dessa família e de pequenos domínios adicionais conservados. Esse trabalho objetivou caracterizar, mediante a obtenção da seqüência completa, dois fatores de transcrição WRKY relacionados aos clones de cDNA MG.LE.EB.A3.0208D3 e MG.LE.EB.A3.0209E3 que foram expressos na linhagem resistente NC-EBR-2 de tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.) 36 horas após a inoculação com o fungo Alternaria solani. A triagem efetuada por PCR de uma biblioteca de fosmídeos da linhagem NC- EBR-2, utilizando-se oligonucleotídeos derivados das seqüências dos clones MG.LE.EB.A3.0208D3 e MG.LE.EB.A3.0209E3, resultou na identificação de um clone fosmídeo correspondente a cada clone. Por meio do seqüenciamento shotgun desses clones, foram obtidas duas ORFs (open reading frame, sequência aberta de leitura) denominadas de LeWRKY1 (fator de transcrição WRKY 1 de L. esculentum) com 1.165pb e LeWRKY2 (fator de transcrição WRKY 2 de L. esculentum) com 1.570pb, correspondente aos clones MG.LE.EB.A3.0208D3 e MG.LE.EB.A3.0209E3, respectivamente. A proteína codificada por LeWRKY1, que apresenta similaridade de seqüência com a proteína NtWRKY3 de Nicotiana tabacum, possui em sua seqüência de 328 aminoácidos um domínio WRKY de ligação ao DNA, um motivo dedo de zinco do tipo Cys 2 His 2, um motivo conservado denominado domínio 1 que constitui um sinal de localização nuclear e um domínio conservado que inclui a região C de ligação a calmodulina. Essas características permitem classificar LeWRKY1 no grupo II, subgrupo d, dos fatores de transcrição WRKY. Esta proteína apresenta também um domínio N-terminal de 41 aminoácidos com função ainda desconhecida. Na região promotora de LeWRKY1 foi observada a presença do elemento promotor TATA box a –55pb e duas regiões W box a – 89pb (WA) e a –76pb (WB) do sítio de início da transcrição. Análise de Southern blot revelou que esse gene está presente em mais de uma cópia no genoma do tomateiro. A proteína codificada pelo gene LeWRKY2 apresentou similaridade de seqüência com a proteína tWRKY4 de Nicotiana tabacum e possui uma seqüência de 291 aminoácidos constituída de um domínio WRKY de ligação ao DNA e um motivo dedo de zinco Cys 2 HisCys, sendo classificada como membro do grupo III dos fatores de transcrição WRKY. A análise por meio de Southern blot indicou que o gene LeWRKY2 está presente em única cópia no genoma do tomateiro. A comprovação e a quantificação da contribuição desses genes na resistência do tomateiro a Alternaria solani depende, entretanto, de estudos de expressão e análise funcional.