Estado viável não cultivável em Salmonella enterica: indução, perfil de proteínas intracelulares e detecção de mRNA - Mendes, Renata Aparecida (2009)
O patógeno de origem alimentar, Salmonella spp. entra no estado viável não cultivável (VNC) em resposta a condições ambientais adversas. A presença de células VNC é um problema de saúde pública porque células neste estado não são detectadas pelas metodologias tradicionais utilizadas de rotina em laboratórios, resultando em avaliação inadequada de alimentos contaminados com patógenos. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a influência da estirpe, do meio de suspensão de células, da concentração salina e da densidade populacional inicial na entrada de Salmonella enterica no estado VNC e estudar o perfil de proteínas intracelulares e a presença de transcritos dos genes invA, rpf, katF e rDNA 16S na população de S. Enteritidis PT4 963 no estado VNC. A população de S. enterica que permaneceu no estado VNC variou significativamente entre as estirpes e condições utilizadas. A perda da culturabilidade foi mais lenta (p<0,001) em células mantidas a 4 °C em meio infusão de cérebro e coração (BHI) acrescido de NaCl do que as mantidas em solução fosfato de Butterfield (BPS). Células mantidas a 4 °C em BHI adicionado de NaCl apresentaram percentual de células viáveis menor (p<0,05) no momento em que a culturabilidade não era mais detectada. A maior perda de culturabilidade foi obtida em meios com 1,2 mol/L de NaCl (p<0,001). As linhagens S. Enteritidis PT4 963 e S. Typhimurium ATCC 14028 mantidas a 4 °C em solução BPS adicionada de NaCl 1,2 mol/L apresentaram os maiores índices de entrada em estado VNC (p<0,001). As menores taxas deperda de culturabilidade e também as maiores reduções nas contagens de microrganismos viáveis foram observadas em densidade populacional inicial de 107 UFC/mL (p<0,05) se comparadas às amostras inoculadas com 105 e 103 UFC/mL. O perfil de proteínas intracelulares de S. Enteritidis PT4 963 no estado VNC difere do encontrado em células nas fases exponencial e estacionária de crescimento e sob resposta a estresse osmótico, por baixa temperatura e falta de nutrientes. A não detecção de proteínas com massa molecular superior a 63 kDa e a presença de proteínas com massas moleculares menores nas células no estado VNC sugerem a ocorrência de proteólise para garantir o aporte de nutrientes e a manutenção de viabilidade. Nossos resultados indicam que o estado VNC constitui um estado fisiologicamente distinto no ciclo de vida de Salmonella enterica sorovar Enteritidis PT4. No entanto, não conseguimos detectar uma proteína específica das células de Salmonella no estado VNC. A quantidade de RNA total diminuiu aproximadamente 600 vezes em células no estado VNC quando comparada à quantidade obtida de células em crescimento ativo. Não foram detectados os transcritos correspondentes aos genes invA, rpf e katF em S. Enteritidis PT4 963 no estado VNC nas condições experimentais utilizadas. Entretanto, a expressão do 16S rRNA foi detectada em células VNC. Estes resultados sugerem que S. Enteritidis PT4 no estado VNC está ativa metabolicamente pela produção de transcritos para o rDNA16S e que este housekeeping gene pode ser considerado um bom marcador de viabilidade celular para Salmonella enterica sorovar Enteritidis PT4 no estado VNC.