Identificação e caracterização de alvos celulares da proteína NIG (NSP-Interacting GTPase) - Machado, João Paulo Batista (2011)
A proteína NSP (nuclear shuttle protein) de geminivírus facilita o transporte intracelular do DNA viral do núcleo para o citoplasma e atua juntamente com a proteína MP (movement protein) na propagação do DNA viral para células adjacentes. No entanto, o mecanismo pelo qual NSP medeia o movimento nucleocitoplasmático do DNA viral não é conhecido. Recentemente, foi identificada uma GTPase, denominada NIG (NSP-interacting GTPase), cujas propriedades estruturais e bioquímicas indicam um possível envolvimento no transporte nucleocitoplasmático do genoma viral, atuando como cofator específico de NSP. Com o objetivo de determinar a função celular de NIG, e assim verificar se esta GTPase desempenha algum papel na translocação do genoma viral, foi realizada uma triagem de proteínas que interagem com o domínio C-terminal (Pro-Rich) de NIG, por meio do sistema de duplo híbrido em leveduras. A estirpe de levedura AH109, previamente transformada com pBDPro- Rich, foi co-transformada com a biblioteca de cDNA de Arabidopsis thaliana, clonada no vetor pEXP-AD502. Os duplos transformantes foram selecionados em meio deficiente dos aminoácidos leucina e triptofano. A seleção da interação entre BD-Pro-Rich e proteínas codificadas pela biblioteca de cDNA fusionadas ao domínio de ativação de Gal4 (AD) foi feita em meio deficiente de histidina, suplementado com 10 mM de 3AT. Entre os cinco cDNAs isolados que apresentaram prototrofia à histidina e atividade de β-galactosidase, CSN5A e At2G41020 foram selecionados para análises mais detalhadas. CSN5A (COP9 Signalosome 5A) é um dos componentes do complexo COP9 signalossomo (CSN) e consiste na subunidade responsável pela atividade de isopeptidase exibida por este complexo. A proteína At2G41020 não possui função conhecida e tem sido associada à maquinaria de spliceossomo, devido à sua homologia com a proteína Npw38 de humanos. A interação in vivo entre NIG e CSN5A ou At2G41020 foi demonstrada por ensaios de complementação de fluorescência bimolecular (BiFC) e parece ocorrer no núcleo, bem como em agregados citoplasmáticos. A confirmação da interação entre NIG e CSN5A in vivo foi reforçada por meio de ensaio de co-imunoprecipitação. A proteína CSN5A, fusionada à GFP, localiza-se tanto no núcleo como no citoplasma, enquanto que a proteína quimérica At2G41020-GFP está localizada predominantemente no núcleo, consistente com um possível envolvimento com o spliceossomo. Embora tenha sido demonstrado que a proteína NIG está localizada no citosol, a coexpressão de YFP-NIG com CSN5A-GFP ou com At2G41020-GFP resultou no seu redirecionamento para o núcleo. Coletivamente, estes resultados apontam CSN5A e At2G41020 como alvos na elucidação do papel funcional de NIG no transporte celular de macromoléculas.