Caracterização de sequências expressas do genoma café potencialmente relacionadas com a resistência a doenças - Alvarenga, Samuel Mazzinghy (2007)
Para isso foram usadas três estrategias. Inicialmente, palavras-chave correspondentes a termos relacionados aos mecanismos de resistência de plantas a patógenos foram identificadas na literatura e utilizadas como “iscas” para a mineração dos dados. Com o auxílio de ferramentas disponíveis na plataforma de bioinformática do PBGC, foram identificadas ESTs (Expressed Sequence Tags) relacionadas a cada uma destas palavras. Outra estrategia utilizada foi a busca por similaridades entre algumas sequências públicas envolvidas com a resistência do cafeeiro a doenças com as sequências do PBGC, por meio do programa BLAST. Utilizou-se, também, o Electronic Northern, uma ferramenta desenvolvida pelo Laboratório de Genômica e Expressão (LGE). A mineração, usando as três estrategias, identificou 14.060 sequências do PBGC. Essas sequências apresentaram similaridade com proteínas conhecidamente relacionadas com o processo de defesa da planta contra doenças como, por exemplo, quitinase, proteína quinase, citocromo P450, proteína de resistência a doenças, proteína relacionada com patogênese, proteínas com domínio LRR e NBS, proteínas induzidas por hipersensibilidade, entre outras. Os processos biológicos com os quais essas sequências estão envolvidas incluíram metabolismo, transporte, regulação da transcrição, enovelamento de proteínas, biossíntese entre outros. A análise global baseada em ontologia de função molecular das sequências obtidas mostrou que os genes estão envolvidos com metabolismo, resposta a estímulos externos, diferenciação celular, ligação a ácidos nucleicos, ligação a nucleotídeos, resposta de defesa, apoptose entre outras. Visando verificar o envolvimento destas sequências com a resistência do cafeeiro a ferrugem foram desenhados 40 primers para amplificar algumas das sequências mineradas. Os primers foram desenhados com o programa computacional Primer3 e a estabilidade desses foi verificada por meio do programa PrimerSe/ect. Diferentes concentrações dos componentes da reação de PCR foram analisadas. Utilizando as condições de reação e amplificação otimizadas, os 40 primers foram testados em 12 genótipos resistentes e 12 susceptíveis a Hemi/eia vastatrix, fungo causador da ferrugem. Vinte e nove destes 40 primers resultaram em bandas únicas e bem definidas, sendo um polimórfico. Este trabalho permitiu obter, até o momento, um marcador molecular polimórfico entre os indivíduos resistentes e susceptíveis. Esse marcador, denominado CARF 005, amplifica uma região do DNA que corresponde a uma ORF parcial de Coffea arabica que codifica uma proteína de resistência a doenças.