Caracterização in silico de genes envolvidos na biossíntese de oligossacarídeos de rafinose em soja e construção de cassetes de silenciamento do gene da estaquiose sintase, via interferência por RNA - Soares, Ana Paula Gomes (2011)
A soja (Glycine max L. Merrill) acumula oligossacarídeos de rafinose (ROs) em suas sementes, principalmente rafinose e estaquiose, os quais são considerados fatores antinutricionais. A redução destes carboidratos em sementes de soja poderia resultar na diminuição dos problemas gastrointestinais gerados a partir da ingestão de produtos derivados de soja e proporcionar um impacto positivo na aceitação dos mesmos. A biossíntese dos ROs é bem caracterizada e envolve a ação sequencial de um grupo de sintases. Entretanto, os genes e o padrão de expressão destas sintases ainda não foram completamente descritos em soja. O objetivo deste trabalho foi caracterizar e analisar a expressão in silico dos genes envolvidos na biossíntese de ROs e construir cassetes de expressão para silenciamento do gene da estaquiose sintase, via interferência por RNA, em soja. Análises computacionais mostram que o genoma da soja apresenta 10 locos que potencialmente codificam sintases de ROs. Destes, seis codificam a galactinol sintase, três a rafinose sintase e um a estaquiose sintase. Os perfis de expressão virtual dos putativos genes para galactinol sintase e rafinose sintase indicam que estes genes são expressos em sementes, folhas e raízes estressadas. Transcritos para estaquiose sintase são mais abundantes em folhas de plantas estressadas que em sementes. O genoma da soja também mostra sete locus que potencialmente codificam proteínas de embebição de sementes ou α-galactosidases alcalinas que são expressos principalmente em sementes. Para redução do conteúdo de ROs em sementes de soja, foram construídos cassetes para silenciamento, via interferência por RNA, do gene que codifica a estaquiose sintase. Os fragmentos isolados contêm sequências correspondentes a duas regiões distintas do gene estaquiose sintase que apresentam alta e baixa identidade com genes de rafinose sintases de soja. Os fragmentos sense e antisense de cada região do gene foram clonados nos vetores pKANNIBAL e pBKN para a síntese simultânea de regiões repetidas e invertidas, resultando em RNA hairpin espaçados por um intron. Foram obtidas quatro construções nas quais duas são dirigidas pelo promotor 35SCaMV e duas pelo promotor da subunidade α da proteína de reserva β-conglicinina. Estas construções foram transferidas para o vetor binário pCAMBIA 3301, para posterior transformação genética de soja.