Otimização do processo fermentativo e análise do secretoma de Kluyveromyces marxianus UFV-3 em meios contendo lactose em diferentes condições de cultivo - Diniz, Raphael Hermano Santos (2013)
Kluyveromyces marxianus UFV-3 é uma levedura que possui metabolismo respiro-fermentativo, ou seja, a fermentação e respiração coexistem, contudo a via fermentativa ou respiratória pode ser favorecida dependendo da concentração de oxigênio e carboidrato no meio de cultivo. Considerando esta característica das leveduras do gênero Kluyveromyces o objetivo deste trabalho foi otimizar a produção de etanol a partir de permeado de soro de queijo (PSQ) e caracterizar o secretoma de Kluyveromyces marxianus UFV-3, tendo em vista o uso desta levedura como uma hospedeira para produção de proteínas heterólogas. Para otimizar a produção de etanol em PSQ foi utilizada a metodologia de superfície resposta (MSR) com delineamento composto central rotacionado (DCCR) avaliando os efeitos de pH (4,5-6,5), temperatura (30-45 ºC), concentração de lactose (50-250 g L-1) e biomassa celular seca (1-2 g L-1). Foram realizadas 29 fermentações em hipoxia além de 7 fermentações para validar a equação obtida na MSR. Temperatura foi o fator mais significante na produção de etanol, seguido de pH, biomassa celular e concentração de lactose. As condições para produção de etanol com rendimentos superiores a 90% foram: temperatura entre 33,3-38,3 ºC, pH entre 4,7-5,7, biomassa celular entre 1,26-1,68 g L-1 e concentração de lactose entre 50-108 g L-1. A equação gerada no processo de otimização foi validada podendo, deste modo, ser utilizada para futuros processos de escalonamento da produção de etanol utilizando K. marxianus UFV-3. Para analisar como as condições de cultivo influenciam a secreção de proteínas de K. marxianus UFV-3, esta levedura foi cultivada em batelada, batelada alimentada (taxa de alimentação inicial Do - 0.05 e 0.1 h-1) e cultura contínua (diluição - D - 0.1 e 0.3 h-1). Os sobrenadantes dos cultivos foram analisados em SDS-PAGE e em todos os cultivos observou-se baixa diversidade de proteínas secretadas. Entretanto nos cultivos em batelada alimentada (Do=0.05 h-1) e cultivo contínuo (D=0.1 h-1) detectou-se uma maior concentração e diversidade de proteínas que nos demais cultivos, além de, em ambos os cultivos, obtivemos uma proteína secretada em maior proporção que as demais. Para identificar as proteínas do secretoma K. marxianus UFV-3 foi cultivada em cultura contínua (D=0.1 h-1) devido à reprodutibilidade deste método, além de, maior controle e homogeneidade dos cultivos. As amostras dos cultivos contínuos foram fracionadas por tamanho em um gel de digestão seguido de separação reversa dos peptídeos em um sistema de nano-LC e posterior identificação dos peptídeos em MALDI-TOF/TOF. De um total de nove proteínas, oito proteínas foram identificadas como sendo estruturais ou de membrana e a proteína que foi diferencialmente secretada no meio foi identificada como endopoligalacturonase endoPG (EC: 3.2.1.15). EndoPG é uma proteína de interesse biotecnológico e foi caracterizada com atividade ótima na temperatura de 59,5 ºC e no pH 5,1. Além disso, verificou-se que esta enzima não é secretada em meio contendo glicose, por outro lado endoPG é secretada em meio contendo lactose, galactose e principalmente em meio contendo glicerol.