Caracterização de uma proteína secretória de soja e de sua interação com BiP - Matrangolo, Fabiana da Silva Vieira (1998)
Proteínas solúveis e de membrana da rota secretora são inicialmente endereçadas ao retículo endoplasmático (RE) e translocadas através da membrana deste. Em seguida, elas transitam através do Golgi para alcançar os compartimentos subcelulares e o meio extracelular. O RE mantém uma eficiente maquinaria de translocação, dobramento, associação, montagem de oligômeros e controle de qualidade de proteínas secretórias. A proteína BiP ("Binding Protein"), residente no RE, exibe atividade de chaperone molecular e participa ativamente neste processo por meio de interações proteína:proteína. Com o objetivo de identificar substratos potenciais de BiP, anticorpos contra frações microssomais isoladas da semente de soja foram usados para o escrutínio de uma biblioteca de expressão. Um clone de cDNA, denominado pUFVS64, que codifica uma proteína secretória, foi isolado e caracterizado. A proteína, codificada por pUFVS64 e denominada S-64, é sintetizada na semente de soja, em baixos níveis, e possui uma identidade de seqüência de 85% com uma proteína de membrana que se liga à sacarose, denominada SBP ("Sucrose Binding Protein"). Células intactas foram utilizadas para introdução de genes via eletroporação, ou biobalística, com o objetivo de aumentar a síntese da proteína S-64 em suspensões celulares de soja, de forma a aumentar a sensibilidade dos ensaios para determinação de associações entre as proteínas BiP e S-64.A associação entre BiP e S-64 foi avaliada, levando-se em consideração características bioquímicas diferenciadas, associadas com as referidas proteínas. Ensaios de sedimentação por afinidade, com o uso das resinas de ATP-agarose, GTP-agarose e ConA- sepharose, foram conduzidos, utilizando-se extratos de proteína total, de suspensões celulares de soja. Tanto S-64 quanto BiP são co-precipitadas por GTP-agarose, embora BiP não se associe com este nucleotídeo. A capacidade da resina GTP-agarose em sedimentar BiP reflete associação prévia entre BiP e uma proteína que liga GTP. Similarmente, ATP-agarose foi eficiente em co-sedimentar ambas as proteínas, embora apenas BiP se ligue diretamente à ATP. A sedimentação indireta de S-64 pela resina ATP-agarose demonstrou que S-64 estava a uma proteína que liga a ATP. A proteína S-64 é glicosilada e se liga diretamente a ConA-sepharose, enquanto BiP não se associa diretamente com concanavalina-A. Mesmo assim, BiP foi co-sedimentada indiretamente por ConA- sepharose. Coletivamente, estes resultados sugerem que S-64 interage com BiP, constituindo um substrato em potencial para caracterização de associações mediadas pela proteína BiP de plantas.