Desenvolvimento de uma plataforma de produção de glicoproteínas por expressão heteróloga de sialiltransferase e interferon-beta em Leishmania tarentolae - Senra, Renato Lima (2018)
A produção de glicoproteínas terapêuticas possui alto custo devido à necessidade de utilização de cultura de células de mamíferos que dependem de meios de cultivo complexos e caros, além de possuírem baixo rendimento de produção. Leishmania tarentolae, um protozoário não patogênico para mamíferos, tem sido sugerido como um sistema alternativo para expressão heteróloga de glicoproteínas devido à existência de métodos eficientes de expressão heteróloga, ser facilmente adaptado para produção em alta escala de baixo custo. Além disso, este protozoário apresenta modificações pós- traducionais ausentes em bactérias e leveduras, organismos mais utilizados para produção industrial de proteínas recombinantes. Entre elas, a proteína interferon-β. Esta é uma molécula glicosilada utilizada no tratamento de doenças neurodegenerativas inflamatórias e autoimunes, como a esclerose múltipla e a artrite reumatoide. Embora o perfil de glicosilação de proteínas expressas em L. tarentolae seja semelhante ao de mamíferos, existem algumas diferenças no perfil de carboidratos presentes nas terminações das cadeias glicídicas devido à ausência de enzimas de biossínteses e incorporação de ácido siálico. A presente proposta de projeto, portanto, teve como objetivo o desenvolvimento de uma plataforma de expressão de interferon-β utilizando linhagens de L. tarentolae selvagem e geneticamente otimizadas para síntese de glicoproteínas com potencial incorporação de ácido siálico na extremidade da cadeia glicídica, proporcionando uma ação mais eficaz das proteínas e reduzindo os custos de produção. As abordagens utilizadas, que visaram entender mais sobre as vias metabólicas encontradas nestes organismos utilizando dados de genômica e metabolômica, indicaram uma alternativa de tornar o sistema de expressão em L. tarentolae mais otimizado pela expressão heteróloga de sialiltransferase, enzima ausente nestes organismos. As linhagens geneticamente modificadas foram obtidas por transfecção com genes otimizados para o gênero Leishmania. A integração das sequências heterólogas de sialiltransferase e IFN-β foi confirmada por PCR e pela presença de transcritos obtidos por RT-PCR. Ensaios de eletroforese em gel de poliacriamida e marcação de proteínas com anticorpos específicos (anti-his e anti-IFN-β) também confirmaram produção heteróloga de proteína nas linhagens selecionadas.