Caracterização molecular de cultivares de soja por meio de um sistema de genotipagem fluorescente utilizando marcadores microssatélites com cauda estendida universal - Ribeiro, Carlos Alexandre Gomes (2011)
O desenvolvimento de sistemas de identificação molecular para determinar e rastrear a identidade genética de um cultivar representa um grande desafio ao sistema de proteção utilizado no país, até então fundamentado em descritores fenotípicos. A identificação de cultivares de soja é feita atualmente no Brasil com base em 30 descritores morfológicos. Marcadores moleculares do tipo microssatélite são largamente utilizados para fins de determinação da diversidade genética, paternidade, análises de pureza varietal e mapeamento genético. Algumas variações da técnica de genotipagem convencional por microssatélite vêm sendo desenvolvidas com o objetivo de adequar a velocidade e automatização de técnicas atuais, com qualidade de análise e baixo custo. Dentre elas, destaca-se um sistema multiplex de genotipagem em sequenciador semi-automático de DNA, que utiliza primers com cauda estendida universal (PCEU). O presente trabalho teve como objetivos padronizar um sistema reprodutível de genotipagem molecular semi-automatizado baseado na metodologia PCEU para a cultura da soja, avaliar diferenças em relação ao sistema de genotipagem convencional, em gel de poliacrilamida e caracterizar com o conjunto de marcadores selecionados, 30 cultivares de soja estimando suas frequências alélicas. Estes descritores genotípicos poderão ser utilizados como ferramenta para a identificação de cultivares e fornecer subsídios para a proteção da propriedade intelectual, determinação e comprovação de pureza varietal. Foram utilizados 30 cultivares comerciais de soja avaliados com um grupo de 22 marcadores microssatélites já descritos na literatura. A genotipagem foi realizada em sequenciador semi- automático (PCEU) e em gel de poliacrilamida (convencional). Dentre os locos analisados, 13 foram selecionados por apresentarem melhor perfil de amplificação, menos produtos stutter, e maior número de alelos. O perfil alélico de cada cultivar foi definido primeiramente em sistema tradicional de genotipagem por eletroforese em gel de poliacrilamida, e depois no sequenciador semi-automatizado. Para a metodologia de genotipagem PCEU, o número total de alelos encontrados foi de 50, variando de 2 (Satt045) a 7 (Satt005). O conteúdo de informação polimórfica (PIC) variou de 0,40 (Satt045) a 0,74 (Satt005) com média de 0,62. Para a metodologia convencional o número de alelos encontrados foi de 38 com uma variação de 2 (Satt045, Satt070 e AF162283) a 5 (Satt005) alelos. O PIC apresentou uma faixa 0,39 (Satt045) a 0,67 (Satt079), com média de 0,56. Os valores de probabilidade de identidade ao acaso diferiram entre os métodos, sendo <10-5 (PCEU) e <10-4 (Convencional). Apesar de diferenças pontuais, observou-se alta correlação entre as matrizes de dissimilaridade genética entre os métodos (0,8026), e os grupos formados apresentaram também alta similaridade e foram concordantes com dados fenotípicos de registro varietal e de genealogia. Além da alta sensibilidade na detecção de alelos de tamanhos muito próximos, o método PCEU permitiu uma identificação mais criteriosa dos artefatos de amplificação. Os grupos de marcadores selecionados em ambas as metodologias permitiram distinguir todas as cultivares analisadas. O método PCEU possui baixo custo quando comparado a técnicas comuns de marcação por fluorescência, além disso, sua alta precisão faz deste um método vantajoso para a caracterização de cultivares e determinação da pureza genética. O grupo de marcadores analisados pode ser usado como um conjunto de descritores genotípicos complementar aos descritores fenotípicos obrigatórios utilizados para fim de proteção de cultivares em testes de distinguibilidade.