Caracterização das reservas de carbono e metabolismo de lipídeos em Pisolithus - Campos, André Narvaes da Rocha (2008)
A mobilização de reservas de carbono é passo metabólico importante para a basidiosporogênese, a germinação de esporos e o estabelecimento das associações ectomicorrízicas. O objetivo deste trabalho foi o de estudar a composição das reservas de carbono durante as etapas de desenvolvimento do basidiocarpo de Pisolithus sp. e de investigar as vias de mobilização destes compostos no micélio, nas micorrizas e nos corpos de frutificação. As análises histoquímicas realizadas revelaram a presença de glicogênio no interior dos basídios e ao longo do desenvolvimento dos esporos. O RNA e as proteínas totais foram detectados nos basídios jovens, enquanto nos esporos maduros detectou-se apenas o RNA. Demonstrou-se a presença e a importância de diferentes biomoléculas no basidiocarpo, confirmando que os lipídeos são o tipo de reserva mais abundante. A análise dos ácidos graxos nas fases de desenvolvimento do basidiocarpo revelou que a composição em lipídeos não varia com a morfologia ou origem geográfica dos corpos de frutificação, sendo o 18:2w6,9 o mais abundante no início do desenvolvimento e o 18:1w9 o predominante nos esporos maduros. A análise de bancos de ESTs, construídos a partir de ectomicorrizas maduras de Pisolithus, permitiu a identificação de genes que codificam as enzimas de diferentes etapas do metabolismo lipídico, além dos que codificam enzimas da glicólise e da gliconeogênese. Os genes que codificam isocitrato liase e malato sintase foram identificados por meio de primers de seqüência degenerada, sendo as seqüências completas obtidas por meio da técnica de Genome Walking. Os genes da isocitrato liase, em ORF de 1897 pb, e o da malato sintase, de 1880 pb, apresentam ambos 5 íntrons e proteínas de 540 aa. A localização deduzida da isocitrato liase é peroxissomal, enquanto a da malato sintase não pôde ser inferida com base na seqüência protéica. Os padrões de expressão gênica para as micorrizas funcionais estabelecidas entre Pisolithus e Eucalyptus globulus e Populus trichocarpa são similares, como revelado pela análise de expressão dos genes do metabolismo lipídico, do ciclo do glioxilato e da gliconeogênese, em PCR em Tempo Real. A exceção foi a regulação positiva dos genes de enzimas de síntese e modificação de ácidos graxos na micorriza P. microcarpus-E. globulus. Os padrões de expressão gênica de peridíolos indiferenciados e jovens foram similares, sendo as principais alterações observadas nos peridíolos maduros e esporos internos. A regulação positiva dos genes relacionados à β-oxidação e ao ciclo do glioxilato nos peridíolos maduros evidencia a utilização de lipídeos durante a formação dos esporos. Da mesma forma, o aumento das taxas de expressão dos genes relacionados à síntese de ácidos graxos nos esporos internos sugere que a síntese das reservas lipídicas ocorre no interior desses propágulos. Os genes que codificam enzimas do ciclo do glioxilato e gliconeogênese no micélio vegetativo são regulados positivamente na presença de acetato e reprimidos por glicose. No entanto, o micélio não foi capaz de metabolizar o [2-13C] acetato de sódio extracelular, acumulando-o nas hifas fúngicas. Após 72 horas de carência de glicose, ocorreu a indução da expressão das enzimas da β-oxidação, do ciclo do glioxilato e da gliconeogênese. Nestas condições, demonstrou-se a ocorrência do consumo das reservas lipídicas nas hifas por meio da coloração com Vermelho do Nilo. A importância do controle transcricional no metabolismo de ácidos graxos de Pisolithus foi demonstrada pela análise conjunta dos dados de expressão gênica com as observações de microscopia e cromatografia gasosa. Os resultados obtidos neste trabalho representam importante avanço na compreensão do metabolismo lipídico em Pisolithus sp.