Atividade proteolítica de Pseudomonas fluorescens em biofilmes e detecção das células por anti-soro policlonal - Machado, Ana Diolina Soares (2006)
Os objetivos deste trabalho foram investigar a formação de biofilmes por estirpes de Pseudomonas fluorescens isoladas de leite cru refrigerado e a atividade proteolítica nesses biofilmes. Pesquisou-se, também, a viabilidade de detecção dessas células no leite, por métodos imunológicos. O potencial de desenvolvimento de biofilmes em superfície de aço inoxidável AISI 304 acabamento # 4 foi avaliado em temperaturas de 7 oC e 22 oC. O número de células de uma cultura mista constituída de sete estirpes de P. fluorescens, aderidas a placas de aço inoxidável aumentou, proporcionalmente ao aumento da população de células planctônicas, atingindo em torno de 108 UFC-CFU.mL-1, após 72 h de incubação em leite desnatado reconstituído (LDR) a 12%, a 22 oC. A maior atividade proteolítica constatada no sobrenadante de LDR 12% em presença de placas de aço inoxidável com células aderidas que, em ausência, sugere que células aderidas, ou, em biofilmes, podem secretar enzimas para o meio externo. A avaliação da adesão de células de culturas puras de P. fluorescens 041 e 097, em meio triptona extrato de levedura e fosfato (TYEP) e em LDR 1% ou 12%, indicou que o meio TYEP estimulou crescimento, mas, não a atividade proteolítica a 7 ºC e 22 ºC. Constatou-se que a capacidade de adesão com desenvolvimento de biofilmes é diferente entre as estirpes de uma mesma espécie. Adesão, formação de biofilmes e a atividade proteolítica são propriedades independentes, nas bactérias avaliadas. P. fluorescens 041 apresentou baixa capacidade de adesão a placas de aço inoxidável a 7 oC e uma alta atividade proteolítica, enquanto o número de células aderidas de P. fluorescens 097 foi da ordem de 109 UFC.mL-1 a 7 oC e 22 oC, mas apresentou atividade proteolítica menor. A observação dos biofilmes em microscópio eletrônico de varredura evidenciou que P. fluorescens 097 formou aglomerados com multicamadas celulares na superfície das placas de aço inoxidável. Anti-soros policlonais produzidos em nove coelhos contra misturas de estirpes de P. fluorescens apresentaram sensibilidades diferentes, com capacidade de detecção de células em concentrações que variaram de 103 UFC-CFU.mL-1 a 108 UFC.mL-1. Os anti-soros produzidos não apresentaram reação cruzada com outras espécies bacterianas contaminantes do leite cru refrigerado, à exceção dos anti-soros 2A e 3A que reagiram com Aeromonas. Aplicando-se técnicas de aglutinação em gota e de imunodot-blot, foram detectadas células de P. fluorescens em LDR 12% em concentrações de 103 UFCCFU. mL-1 e 105 UFC-CFU.mL-1. Estes resultados indicam o potencial desses procedimentos, para detectar células das bactérias deterioradoras, em uma faixa de concentração não-comprometedora da qualidade do leite.