Vitrificação de ovócitos imaturos de bovinos - Santos, Giancarlo Magalhães dos (2011)
Objetivou-se avaliar o efeito de soluções vitrificantes e da vitrificação em ovócitos imaturos bovino. Os ovócitos foram obtidos a partir de ovários coletados de fêmeas bovinas logo após o abate, selecionados morfologicamente e distribuídos de acordo com os tratamentos. O procedimento experimental foi dividido em duas fases. Na primeira fase foi testada a toxicidade de soluções de vitrificação. Na segunda fase, foi testado o efeito da vitrificação. Na primeira fase, os ovócitos foram submetidos à maturação in vitro após manutenção em diferentes soluções de vitrificação (61 tratamentos). Foram testadas soluções de equilíbrio (SE) de 3, 8, 16, 20, 32 e 40% de Etilenoglicol (EG) em tempos (TE) de 1, 2, 4, 5, 6, 8 e 10 minutos e posteriormente mantidos por 1 minuto em solução de vitrificação (SV) contendo 40% de EG e 1,0 mol.L-1 de sacarose. O mesmo procedimento foi realizado, porém, utilizando solução de vitrificação contendo 25% de EG, 25% de DMSO e 1,0 mol.L-1 de sacarose. Após estes procedimentos, os ovócitos foram reidratados e submetidos ao cultivo in vitro por 24 horas. Observou-se maturação nuclear em grande parte dos tratamentos com exceção das combinações de SE com 32 e 40% de EG nos diferentes TE. Da mesma forma, os ovócitos expostos à SV de 25% de EG + 25% de DMSO + 1 mol.L-1 de sacarose não possibilitaram a maturação. Os melhores resultados foram as soluções de SE contendo 3%, 16%, expostas por cinco minutos e 20% de EG, expostas por 10 minutos (76,7, 57,1 e 66,7% de ovócitos em metáfase II, respectivamente). Todos estes tratamentos foram expostos ao final do equilíbrio à SV, contendo 40% de EG + 1,0 mol.L-1 de sacarose. Na segunda etapa, ovócitos foram submetidos aos procedimentos conforme descrito na primeira fase. Foram testadas SE com 3% de EG (por 1, 5, 6, 8, e 10 minutos), 8% de EG (por 1, 5 e 10 minutos), 16 e 20% de EG (por 5 e 8 minutos). Posteriormente, os ovócitos foram mantidos por 1 minuto em SV contendo 40% de EG e 1,0 mol.L-1 de sacarose. Posteriormente, os ovócitos foram envasados em palhetas de 0,25 mL, vitrificados (imersos em nitrogênio líquido) e posteriormente desvitrificados, rehidratados e submetidos à maturação in vitro por 24 horas. Observou-se que as combinações SE com 3% de EG, com TE de 1, 5, 6, 8 e 10 minutos proporcionaram taxas de metáfase II de 10,4; 19,3; 10,0; 7,6 e 14,3% respectivamente. As combinações SE com 8% de EG, com TE de 1, 5 e 10, e SE com 16% de EG, com TE de 5 minutos e SE de 20% de EG, com TE de 8 minutos proporcionaram taxas de metáfase II de 12,9; 6,9; 2,4; 23,1 e 2,0% respectivamente, sendo que todas diferem (P<0,05) ao grupo testemunha (73,7%). Foram processados ovócitos para a avaliação da ultraestrutura e expressão gênica. A ultraestrutura indicou que ovócitos de todos os tratamentos testados (exceto o grupo testemunha) apresentavam organelas degeneradas. Adicionalmente, não foi observada a distribuição citoplasmática típica de mitocôndrias de um ovócito maduro. Já na expressão gênica observou-se que ovócitos expostos a solução de equilíbrio de 16% de EG em tempo de cinco minutos apresentam maior quantidade de transcritos relacionados com o estresse oxidativo (HSP 70.1). No entanto, os transcritos da transcrição materno-zigótica (MATER e ZAR1) foram sub-regulados (P<0,05). Conclui-se que os procedimentos de desidratação testados para vitrificação de ovócitos, com exceção das combinações de SE com 32 e 40% de EG nos diferentes TE, podem não comprometer a taxa de maturação nuclear após maturação in vitro . Entretanto, comprometem a integridade ultraestrutural, a maturação citoplamática e a expressão gênica.