Propriedades bioquímicas e cinético-enzimáticas de cisteíno- proteases do intestino médio da lagarta da soja - Mendonça, Eduardo Gomes de (2008)
Inibidores de protease que atuam em proteases específicas de insetos são candidatos para terem seus códigos genéticos inseridos em plantas geneticamente modificadas. Um primeiro passo para se alcançar isso é a caracterização das enzimas proteolíticas do intestino desses insetos. Cisteíno-proteases da Fração solúvel e da Fração insolúvel do intestino médio de Anticarsia gemmatalis foram caracterizadas utilizando o substrato L-BApNA. A Fração solúvel, chamada de Fração I, foi obtida do sobrenadante após nove ciclos de congelamento e descongelamento do intestino de A. gemmatalis e a Fração insolúvel, chamada de Fração II, obtida da maceração com o detergente Brij 35 do pellet resultante da Fração I. Verificaram-se dois valores de pH com pronunciada atividade em ambas as Frações, sendo eles pH 3,6 e 8,0 para a Fração I e 4,6 e 8,0 para a Fração II. Já o pico de atividade quando testada a influência da temperatura foi em 35oC para a Fração I e 60°C para a Fração II. O KM app encontrado para as Frações I e II foram de 2,28 mM e 0,44 mM respectivamente. A Vmáx app para as respectivas Frações foram 297,68 nM.s-1 e 122,95 nM.s-1. Quatro inibidores de proteases foram testados, sendo cada um deles de uma classe de protease: TLCK (inibidor de serino-protease), E-64 (inibidor de cisteíno-protease), EDTA (inibidor de metaloprotease) e Pepstatina A (inibidor de aspartil- protease). A inibição mais pronunciada foi verificada quando E-64 foi adicionado ao meio para ambas as Frações, uma vez que todas as concentrações testadas diminuíram significativamente a atividade de cisteíno-protease. Um aumento de TLCK no meio fez com que a atividade de cisteíno-protease caísse gradativamente devido à reação desse com resíduo de aminoácido histidina na tríade catalítica, o qual faz parte de tríade de cisteíno-protease também. O efeito de EDTA na atividade de cisteíno-protease de A. gemmatalis sobre L-BApNA mostra a diferença entre as duas Frações analisadas. A Fração I não depende de íons divalentes como Ca2+ para sua atividade. Já a Fração II é cálcio-dependente, pois EDTA diminuiu significativamente sua atividade. Pespstatina A não influenciou cisteíno-proteases da Fração I, exercendo pouca influência na Fração II.