Defosforilação de caseínas por via enzimática e química - Silva, Naaman Francisco Nogueira (2010)
No leite, as micelas de caseína encontram-se sob a forma de uma associação de moléculas altamente hidratadas, que são acessíveis às moléculas do solvente. Essa característica permite que as micelas de caseínas sejam passíveis de modificações quando as condições físico-químicas do meio são alteradas ou quando enzimas específicas são adicionadas ao leite. Nesse contexto, o objetivo geral do trabalho foi modificar a estrutura micelar das caseínas por meio da defosforilação por via enzimática (por fosfatases) e química (por acidificação). Inicialmente, foi realizada a defosforilação em suspensões de caseinato de sódio e de cálcio utilizando fosfatase alcalina de bezerro (FAL) (EC 3.1.3.2, Sigma, Saint Louis, USA). Observou-se que ambas as suspensões de caseinato foram defosforiladas por FAL e que a presença de cálcio influenciou negativamente a defosforilação. Após analisar a defosforilação em substratos mais simples, o foco do trabalho passou a ser a modificação das micelas de caseína em leite esterilizado (UHT) desnatado, utilizando FAL e fosfatase ácida de batata (FAC) (EC 3.1.3.1, Sigma, Saint Louis, USA). Entretanto, os perfis cromatográficos (HPLC/PR) e os espectros de massa (ESI/MS) das amostras de caseinato e leite demonstraram que as enzimas FAL e FAC estavam contaminadas por enzimas proteolíticas. Logo, a defosforilação observada em leite UHT desnatado ocorreu devido a duas possibilidades. Uma dessas possibilidades é que as Massas Molares das enzimas FAL e FAC não inviabilizaram seu acesso ao interior das micelas, e o envolvimento dos resíduos de fosfosserina na formação de fosfato de cálcio coloidal não impediu a defosforilação. Contudo, após verificar proteólise em ambas as amostras adicionadas de FAL e FAC, a defosforilação pode também ter ocorrido nos peptídeos fosforilados liberados para fase contínua do leite. Uma vez que tal contaminação inviabilizaria o conhecimento preciso da perda de grupos fosfato nas características das micelas de caseína, modificou-se a forma de defosforilação, que passou a ser de origem química, por acidificação. Para isso, leite cru desnatado foi acidificado a pH 5,5, 6,1 e 6,7 (controle sem acidificação) a fim de solubilizar o fosfato de cálcio coloidal presente no interior das micelas de caseína. Após a acidificação as amostras foram dialisadas contra ultrafiltrado de leite, liofilizadas e ressuspendidas a 10 % (m/m). Como a etapa de acidificação leva à solubilização de outros minerais além do fósforo (Ca, Mg e citrato), a defosforilação por via química pode ser mais precisamente denominada de desmineralização. Os resultados indicam que a desmineralização das micelas de caseína em leite cru desnatado não influenciou características como potencial zeta, tamanho médio, distribuição de tamanho e hidratação micelar. Por outro lado a cor e o percentual de caseínas sedimentáveis diminuíram com o avanço da desmineralização. Esses resultados sugerem que as amostras desmineralizadas apresentavam caseínas como uma mistura de caseinato e micelas de caseína. À medida que a desmineralização foi mais intensa, a proporção de micelas de caseína diminuiu.