Desenvolvimento e utilização de marcadores moleculares para seleção de cafeeiros resistentes à ferrugem - Almeida, Dênia Pires de (2015)
A ferrugem alaranjada causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix Berk. et Br. é considerada em todo o mundo uma séria doença do cafeeiro que tem causado vários prejuízos para a cafeicultura. O uso de fungicidas é o método mais empregado para o controle da doença, porém sua aplicação deve ser feita de forma racional, para não inviabilizar a cultura e agredir o meio ambiente. Na busca por cultivares resistentes, já foram identificados nove genes dominantes de resitência a H.vastatrix presentes em cafeeiros de diferentes espécies. Uma potencial estratégia para introgredir esses genes de resistência no cafeeiro é o uso de marcadores moleculares. Logo, objetivou-se com esse trabalho, converter marcadores AFLPs ligados a locos de resistência do cafeeiro à raça I, II e ao patótipo 001 de H. vastatrix em marcador SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) e avaliar a eficiência do uso desses marcadores e de um microssatélite previamente identificado na Seleção Assistida por Marcadores (SAM). Para isso, quatro combinações de primers AFLPs ligados à resistência do cafeeiro à raça I, II e ao patótipo 001 de H. vastatrix foram clonados e sequenciados. Os marcadores SCAR desenvolvidos foram denominados de SCAFs e, posteriormente, validados nos genitores resistente Híbrido de Timor UFV 443-03; genitor suscetível Catuaí Amarelo IAC 64 (UFV 2148-57) e em 247 indivíduos da população F2 de mapeamento. Os dados foram codificados e analisados no programa GQMOL. Com as sequências dos SCARs foi feita uma busca local no banco de dados do genoma de referência de Coffea canephora utilizando a ferramenta BLAST, e-value de -27. A fim de identificar quais genes estão envolvidos nas regiões dos cromossomos onde os SCARs apresentaram maior similaridade, foi realizada uma busca local utilizando a ferramenta Gbrowse, e-value de -10. Para a realização da SAM foram genotipados o marcador SCAF2 validado e um marcador microssatélite SSR16 em indivíduos das populações F3 e de retrocruzamentos suscetíveis. Na realização da fenotipagem dos 16 discos de folhas de 1,5 cm de diâmetro de cada planta dos genitores, da geração F3 e dos retrocruzamentos foram inoculados com uredósporos da raça II. Após as inoculações, os discos foram colocados sobre uma tela de nylon e espuma, saturada com água e acondicionados no interior de um gerbox. Os gerbox contendo os discos de folhas, foram fechados e mantidos na ausência de luz durante 48 horas, a 22oC e, em seguida, transferidos para uma câmara sob condições controladas de temperatura de 22°C e 12 horas de luz. No momento em que os discos inoculados do genitor suscetível Catuaí Amarelo IAC 64 (UFV 2148-57) iniciou a esporulação, em torno dos 25 dias após a inoculação (dpi), foi iniciada a avaliação de resistência/suscetibilidade. Na validação dos marcadores SCARs apenas o marcador SCAF2 apresentou polimorfismo entre os cafeeiros resistentes e suscetíveis, se comportando como marcador dominante em repulsão. Os outros marcadores SCARs desenvolvidos não apresentaram polimorfismo entre os cafeeiros quando os fragmentos foram analisados em gel de agarose. Logo, somente o marcador SCAF2 foi validado mantendo o mesmo ordenamento no grupo de ligação 2 (GL2) do mapa genético de ligação, ficando ligado a 0 cM do AFLP que lhe deu origem. Na busca local no genoma de C. canephora encontrou-se maior similaridade dos marcadores SCAF1, SCAF2 com o cromossomo 0, chamado de ChrUn, e maior similaridade dos marcadores SCAF3 e SCAF4 com o cromossomo 10. Na identificação dos genes, os marcadores SCAF1 e SCAF2 pertencentes ao GL2 do mapa genético apresentaram similaridade com alguns genes que codificam proteínas relacionadas à resistência a patógenos. Na SAM, foi verificado que o uso dos marcadores moleculares permitiu selecionar indivíduos homozigotos dominantes para um dos locos e para os dois locos, sendo mais eficiente que a fenotipagem. Logo, com o desenvolvimento de marcadores SCAR e SSR16 intimamente ligados aos locos de resistência à ferrugem do cafeeiro e seu uso na SAM possibilitaram um avanço nos programas de melhoramento com a seleção precoce de indivíduos e também uma posterior clonagem posicional de genes ligados à resistência a essa doença.