Construção e expressão heteróloga de domínio III da proteína de envelope (E) dos vírus dengue -1e - 3 em Pichia pastoris - Paixão, Vinicius Ferreira da (2014)
A dengue é a arbovirose mais importante do mundo colocando em risco quase metade da população mundial, classificada como uma Doença Tropical Negligenciada. É de suma importância o desenvolvimento e melhoramento das metodologias de diagnóstico bem como vacinas para dengue. Entretanto o desenvolvimento dessas são limitados pela dificuldade de produção em grande escala de antígenos a serem usados na captura do anticorpo presente no soro de pacientes infectados e para a imunização de cobaias. Devido a este fator limitante, este trabalho teve como objetivo produzir antígeno em grande quantidade e qualidade do domínio III da proteína E dos VÍRUS DENGUE. Para tanto, a P. pastoris foi utilizada por ser uma levedura que tem por natureza um padrão de modificações pós-traducionais em suas proteínas semelhantes dos padrões de mamíferos quando comparamos este gênero (Pichia) com outros gêneros de leveduras já utilizados em expressão heteróloga. Sequências de DNA correspondes ao domínio III da proteína E de DENV-1 e -3 foram inseridos na construção pTZ/domIIIDENV1 e pTZ/domIIIDENV3 e clonadas em E. coli, e os insertos domIII DENV-1 e de -3 foram liberados por digestão com as enzimas de restrição EcoRI e NotI e, posteriormente ligados ao vetor de expressão pPICzαA em leveduras. As construções resultantes pPICzαA/domIIIDENV1 e pPICzαA/domIIIDENV3 também foram clonadas em E. coli e com elas P. pastoris GS115 foram transformadas por eletroporação e selecionadas em meio com ZeocinTM. Todas as construções e a transformação foram confirmadas através de PCR. Uma vez obtidas a as linhagens recombinantes foi feita a expressão da proteína domIIIDENV1, e por técnicas sorológicas como ELISA indireto com IgM e IgG de pacientes soropositivos para Dengue foi confirmada a grande similaridade da proteína heteróloga expressa e a proteína nativa, uma vez que estas técnicas são extremamente sensíveis e específicas por dependerem da ligação antígeno-anticorpo. Este trabalho vem demonstrar o grande potencial para produção em larga escala do antígeno Domínio III da proteína de Envelope dos vírus dengue 1 e 3 para construção de kits diagnóstico e melhorias no controle da dengue.