Purificação parcial e caracterização bioquímico-cinética de α-galactosidase de Aspergillus terreus - Ferreira, Joana Gasperazzo (2007)
A α-galactosidase apresenta grande capacidade para hidrólise de ligações α-1,6 nos oligossacarídeos de galactose (GO) como a rafinose [O-α-Dgalactopiranosil-(1→6)-D-glicopiranosil-(1→2)-β-D-frutofuranosídeo]. Esses açúcares estão presentes nas sementes de soja, e são responsáveis por distúrbios gastrintestinais relacionados com a ingestão de produtos derivados de soja, devido a ausência da enzima α-galactosidase na mucosa intestinal de humanos e animais monogástricos. Dessa forma, a hidrólise dos GO de produtos de soja poderá contribuir para melhorar o seu valor nutritivo. O objetivo desse trabalho foi produzir, purificar e caracterizar uma isoforma extracelular da α-galactosidase do fungo Aspergillus terreus, e avaliar a capacidade da enzima em promover a redução ou eliminação dos oligossacarídeos de galactose presentes em leite de soja. O fungo A. terreus foi cultivado em meio mineral líquido contendo farelo de trigo como fonte de carbono por 7 dias a 28 °C. O extrato enzimático foi submetido à cromatografia em resinas de Sephacryl S-200, Phenyl-Sepharose e DEAE-Sephacel. A última etapa de purificação resultou na enzima parcialmente purificada com um fator de purificação de 26,96 vezes e um rendimento de 19,07%. A massa molecular da enzima foi estimada por eletroforese desnaturante (SDS-PAGE 12,5%) e por cromatografia de exclusão molecular em Sephacryl S-200, de 50 kDa e 77,3 kDa, respectivamente. Atividade máxima da α-galactosidase foi determinada em pH 5,0 e 55 °C. Quando a enzima foi incubada por 6 horas no intervalo de pH 4 6, ela manteve mais de 90% da atividade inicial. A α-galactosidase de A. terreus a 50 °C perdeu 39% de sua atividade após 151 horas de incubação. Na temperatura de 55 °C a enzima conservou 33% de sua atividade após 52 horas de incubação. A 60 °C, a enzima manteve 92% da atividade inicial por 30 minutos. Na temperatura de 55 °C a meia-vida da enzima foi de 35 horas e a 60 °C de 103 minutos. Para os substratos sintéticos, a enzima demonstrou ser muito seletiva, apresentando maior afinidade pelo substrato ρ-NP-αGal. A enzima hidrolisou os substratos naturais melibiose, estaquiose e rafinose, apresentando também capacidade de hidrolisar os polímeros goma guar e goma locusta. O valor de KM ap para o substrato ρ-NP-αGal foi de 0,75 mM, para a melibiose de 7,39 mM, para a rafinose de 32,99 mM e para a estaquiose de 54,74 mM. A atividade enzimática foi totalmente perdida em presença de Ag+ e parcialmente perdida quando em presença de Cu2+ e galactose. Na presença do substrato ρ-NP-αGal a enzima foi inibida competitivamente por galactose (Ki 0,61 mM). A energia de ativação foi calculada para os substratos ρ-NP-αGal (65,85 kJ/mol), melibiose (39,77 kJ/mol), rafinose (42,98 kJ/mol) e estaquiose (47,27 kJ/mol). A enzima α-galactosidase de A. terreus não converteu o sangue tipo B em tipo O. Após 12 horas de incubação da α-galactosidase purificada com leite de soja a 50 °C, pode-se observar que a enzima hidrolisou 100 % da rafinose e 60,3 % da estaquiose, mostrando que a α-galactosidase de A. terreus foi eficiente na redução de GO presentes no leite de soja.