Otimização de protocolo para obtenção de cromossomos metafásicos de alta qualidade citogenética em meristemas radiculares de milho (Zea mays) - Miranda, Daniel Pereira (2017)
O milho (Zea mays) é considerado uma espécie modelo nos estudos citogenéticos de plantas. Contudo, existem dificuldades em se obter cromossomos metafásicos de qualidade e em quantidade. A sincronização celular com hidroxiureia (HU) seguida da utilização de agentes bloqueadores do ciclo celular sob pressão negativa de vácuo podem ser eficazes para alcançar um alto índice metafásico. Além disso, diferenciar metáfases com cromossomos bloqueados dos não bloqueados é uma prática essencial para se obter cromossomos com morfologia delimitada para a montagem do cariograma. O objetivo do presente trabalho foi desenvolver um protocolo para obtenção de alto índice metafásico apresentando cromossomos bem distendidos e de qualidade citogenética em quantidades suficientes para serem disponibilizados em aplicações que envolvam técnicas moleculares e genômicas em Zea mays. As raízes de milho foram tratadas no experimento I sem sincronização celular, que consistiu de 4 tratamentos: T1: sem APM e sem pressão negativa de vácuo; T2: sem APM com pressão negativa de vácuo (-570 mmHg); T3: com APM e com pressão negativa de vácuo e T4: com APM sem pressão negativa de vácuo. Os períodos de tempo de cada tratamento foram: 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36 e 40 min. As raízes foram tratadas com Feulgen e em seguida realizou-se a digestão enzimática, esmagamento celular e análise de imagens do material sobre a lâmina. Os experimentos II e III consistiram de células sincronizadas com ação da HU. Após as análises das contagens de células do experimento I, os tempos de 32 minutos com APM com vácuo e 40 minutos com APM sem vácuo foram selecionados para dar continuidade conforme seus os índices mitóticos e metafásicos. Os experimentos II e III consistiram no tempo de recuperação das raízes, porém com a utilização de 1,75mM de HU. Os tempos de recuperação variaram em períodos de 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270 e 300 minutos com 3 raízes retiradas a cada intervalo de tempo. Os procedimentos de fixação, visualização do DNA, digestão enzimática e esmagamento, captura e análise das imagens seguiram os mesmos passos do experimento I. As raízes absorveram APM suficiente para bloquear o ciclo celular no período de tempo máximo de 40 minutos. Após a sincronização do ciclo celular, a porcentagem média de metáfases aumentou principalmente no tratamento T1 (32 min. com APM e vácuo) do experimento II após 4 horas de recuperação com 33,15 % de metáfases. Foi possível discriminar metáfases bloqueadas das não bloqueadas, com base na morfologia dos cromossomos, constrições bem visíveis e níveis de compactação cromossômica. A pressão negativa de vácuo permitiu obter metáfases em quantidade e qualidade suficientes para serem aplicados em técnicas de bandeamento, análises genômicas e citomoleculares.