Clonagem e expressão de serino-proteases de Anticarsia gemmatalis e caracterização cinético-enzimática de tripsinas-like purificadas, produzidas por sua microbiota intestinal - Pilon, Franciny Martins (2012)
A lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis, é considerada uma das principais pragas da cultura da soja. Os danos causados pelo ataque deste inseto associado à relevância econômica do cultivo da soja para o Brasil e para o mundo fomentam a busca por alternativas no controle deste inseto. Estratégias de controle de insetos-pragas baseadas no uso de inibidores de proteases têm sido estudadas e o conhecimento das enzimas digestivas tem se mostrado fundamental. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo identificar genes de serino-proteases de A. gemmatalis e avaliar sua expressão diante de inibidores de serino-proteases bem como purificar e caracterizar serino-proteases produzidas pela microbiota intestinal da lagarta da soja. Foram isolados três genes distintos de serino proteases do genoma da lagarta da soja chamados de Agem 1, Agem 2 e Agem 3, indicando que os genes de serino-proteases de A. gemmatalis estão organizados em família multigênica. Os três genes mostraram alta identidade com tripsinas de outros insetos da ordem Lepidoptera. Foi verificado que a expressão do gene Agem 2 se sobressaiu em relação ao gene Agem 1 e Agem 3. As sequências descritas neste trabalho evidenciaram ser genes de tripsinas sensíveis e/ou insensíveis ao inibidor de serino-protease Benzamidina. O inibidor sintético Berenil foi potencialmente eficiente na supressão dos genes de tripsinas isolados neste estudo. Os genes de tripsinas isolados mostraram serem sensíveis aos inibidores proteicos da soja SKTI e SBBI, diminuindo sua expressão durante o tratamento. Esses estudos mostram que o significado da expressão diferencial de proteases digestivas diante de inibidores de proteases nunca pode ser subestimado. O processo de purificação das enzimas produzidas por Bacillus cereus, Staphylococcus xylosus, Enterococcus mundtii e Enterococcus gallinarum isoladas do trato intestinal de A. gemmatalis, foi realizado em cromatografia de afinidade (p-aminobenzamidina). As massas moleculares estimadas das enzimas foram de aproximadamente 25 kDa (SDS-PAGE). As enzimas apresentaram maior atividade em temperatura a 40ºC e em pH 7,5 para B. cereus, pH 10,0 para E.munditti, e pH 8,5 para S.xylosus e E.galinarum. Os íons cálcio não afetaram a atividade enzimática nas concentrações testadas. Os valores de KM da serino protease de E. gallinarum, B. cereus, S. xylosus e E. mundtii foram de 0,35mM, 0,18 mM, 0,21 mM e 0,22 mM, respectivamente. As enzimas foram sensíveis à inibição por inibidores típicos de serino- proteases e tripsina, como Aprotinina, Berenil e SKTI. Suas atividades não foram alteradas pelos inibidores TPCK de quimiotripsina, Pepistatina A de aspartil-proteases, E-64 de cisteíno-proteases e EDTA de metalo-proteases. Esses resultados em conjunto demonstram que as bactérias sintetizam e excretam no lúmen intestinal de A. gemmatalis enzimas tripsinas-like com características semelhantes às produzidas pelo próprio inseto. Através do conhecimento obtido neste trabalho surgem novas perspectivas para a realização de pesquisas complementares que poderão contribuir para o desenvolvimento de estratégias de controle de pragas baseadas na inibição de proteases digestivas, tanto produzidas pelo inseto quanto pela sua microbiota intestinal.