Expressão e produção de monoxigenases bacterianas em komagataella phafii (pichia pastoris) para utilização como enzimas acessórias para desconstrução de biomassa - Santos, Fernanda Pinheiro dos (2017)
A descoberta das monoxigenases de polissacarídeos líticas dependentes de cobre (LPMOs), que agem em sinergismo com outras enzimas na desconstrução da celulose, gerou um grande interesse da comunidade científica por seu potencial de aplicação na produção de biocombustíveis a partir de resíduos lignocelulósicos. A busca por essas proteínas auxiliares em microrganismos surgiu como uma estratégia promissora, pois há grande diversidade de isoformas e disponibilidade de sequências genômicas dessas proteínas. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo expressar LPMOs recombinantes de origem bacteriana em levedura Komagataella phafii. Foram obtidos clones de K. phafii transformados com 6 genes selecionados a partir de banco de dados. Análises da cinética de expressão proteica por técnica de western blot indicaram secreção apenas da LPMO de 25 kDa codificada pelo gene de Thermobifida fusca YX. Ensaios de produção da LPMO de T. fusca foram realizados em biorreator de 1L e Erlenmeyers de 250 mL e 1000 mL. Nos ensaios em Erlenmeyers houve a detecção da proteína, confirmada por SDS-PAGE e western blot, acompanhado de um alto crescimento microbiano. No ensaio em biorreator não houve detecção da proteína de interesse e o crescimento microbiano foi baixo. Com a confirmação da expressão da LPMO nos ensaios em Erlenmeyers, estes foram parcialmente purificados e avaliados por gel de proteínas e western blot. Os resultados obtidos mostram que o sistema de expressão de K. phafii foi eficiente, expressando a LPMO de T. fusca.