Caracterização molecular e interpretação clínica de rearranjos cromossômicos equilibrados associados com alterações fenotípicas - Oliveira, Mariana Moyses [UNIFESP] (2018)
O mapeamento preciso dos pontos de quebra de rearranjos cromossômicos equilibrados associados a alterações fenotípicas pode levar ao reconhecimento de novos loci genômicos associados a doenças e ao melhor entendimento de mecanismos de formação de alterações cromossômicas. O estudo de mulheres com alterações fenotípicas e translocações equilibradas envolvendo o cromossomo X apresenta um potencial ainda maior de contribuir para o entendimento do genoma humano, uma vez que oferece a oportunidade de se avaliar a correlação genótipo-fenótipo levando em consideração a inativação preferencial do cromossomo X normal. O presente trabalho teve como objetivo estudar os mecanismos patogênicos responsáveis pelas alterações clínicas de pacientes com translocações equilibradas, buscando genes rompidos pelos pontos de quebra ou próximos aos pontos de junção, candidatos para os seus fenótipos. Adicionalmente, objetivou-se avaliar a natureza das sequências rompidas pelas quebras cromossômicas e as cicatrizes deixadas nos pontos de junção. Primeiramente, 11 pacientes com translocações equilibradas e fenótipo alterado tiveram seus pontos de quebra mapeados por metodologias de citogenética clássica e molecular associadas com sequenciamento de nova geração. Em seguida, os pontos de junção dos rearranjos foram sequenciados, resultando numa resolução de par de base. Foi observada a ruptura de nove genes nos pontos de quebra de sete pacientes e, em dois casos, foram detectadas fusões gênicas. Sete desses genes tiveram a sua expressão alterada e dois deles puderam ser definidos como a causa do fenótipo dos pacientes. Quatro translocações não romperam genes, sugerindo outros mecanismos patogênicos mais complexos nesses casos. Quatro genes foram considerados como potencialmente afetados por efeito de posição e foi demonstrada a alteração da expressão de um deles. Verificou-se que a junção das extremidades não homólogas foi o mecanismo de formação inferido com maior frequência e que 65% das regiões de pontos de quebra mapeadas afetavam elementos de repetição. Dentre esses casos de rearranjos equilibrados, descrevemos uma paciente com translocação X-autossomo equilibrada, com ruptura da região promotora do gene AMMECR1 no ponto de quebra do cromossomo X, o que ocasionou a ausência de cópias funcionais desse gene. AMMECR1 é um gene de função desconhecida e a consequência clínica de sua perda de função ainda não havia sido descrita. A partir dessa paciente com translocação, e de outros quatro indivíduos do sexo masculino com variantes deletérias envolvendo o AMMECR1, foi observado que a perda de função deste gene acarreta baixa estatura, atraso do desenvolvimento neuropsicomotor, alterações ósseas e cardíacas e perda de audição. A modelagem in vivo por meio de knockdown do ortólogo do AMMECR1 em zebrafish confirmou parte dessa correlação genótipo-fenótipo. Em humanos, a superexpressão do AMMECR1L, um parálogo localizado no cromossomo 2, corresponde a um possível mecanismo de compensação da perda de função do AMMECR1. A proteína AMMECR1 é extremamente conservada ao longo da evolução e apresenta dobras (folds) que potencialmente interagem com ácido nucleico. Além disso, neste estudo foi observado que a proteína AMMECR1 é expressa no núcleo da célula e que a rede de interação desse gene é enriquecida para genes que participam do controle do ciclo celular, sugerindo que a AMMECR1 também exerça um papel nesse processo biológico. Neste estudo, também foi demonstrado que Ammecr1 e Ammecr1l são expressos em tecidos embrionários de camundongo que originam os tipos celulares afetados pelo fenótipo dos pacientes com a perda de função do gene. Para que fosse realizada a quantificação precisa da expressão gênica por RT-qPCR, foi necessário o estudo prévio da estabilidade da expressão de genes de referência comumente usados como controle interno metodológico. De maneira geral, a abordagem metodológica aplicada neste trabalho permitiu a identificação de genes candidatos para o fenótipo dos pacientes com translocações equilibradas, a exploração dos possíveis impactos dos rearranjos na organização da cromatina e a análise de seus mecanismos de formação. Em especial, a descrição das consequências fenotípicas da perda de função do gene AMMECR1 auxiliará no diagnóstico de outros pacientes com doenças genéticas, enquanto que o estudo da função do AMMECR1 levará ao melhor entendimento do controle do ciclo celular. Este trabalho reforça a relevância de se mapear os pontos de quebra de rearranjos cromossômicos equilibrados com alta resolução para a busca de novos genes candidatos para doenças humanas.